19楼: Originally posted by haitian0625 at 2013-01-25 18:48:21
同意2楼说法，酶切貌似不完全，不过你酶量加的很多了，不知多少浓度的酶，按照NEB官网，你的酶量已经在20U左右了。还是再尝试延长酶切时间吧。弱弱的问下，你双酶切后没小片段，双酶离得很近？

21楼: Originally posted by liurz at 2013-01-25 22:11:54
酶用量的确是10u和20u，但这是NEB的推荐用量，他们那个说明书也不算太详细，只写了加样的体积。
双酶切只是切下几个保护碱基而已，切的是目的基因。...

17楼: Originally posted by liurz at 2013-01-25 16:13:39
我准备下次稀释5倍上样，尽量使亮度相当，这样才好估计。
第一次做这些实验，总感觉目的基因与质粒的比例越大越好，所以就尽量多切些目的基因。另外对浓度估计也不准，所以结果就这样了。...

22楼: Originally posted by haitian0625 at 2013-01-26 00:53:27
个人觉得你酶切前上样可以少上些，这样利于你根据marker估计样品浓度；50ul体系，10U就够了；若你只是切掉两端保护碱基、酶切前后片段差不多大小的话，那你酶切后图谱应该是切得多了。所以，可减少酶量、减少酶切时 ...

23楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-26 08:06:02
relax, 以后做多了你就知道了，克隆实验按照量来会事半功倍的。...