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liurz

金虫 (正式写手)

[求助] Xho I 和Not I双酶切后电泳出现严重拖尾

Xho I 和Not I双酶切后电泳出现严重拖尾,如图分别是酶切前后图片。请分析一下原因谢谢。酶切体系为20ul,其中两内切酶各1ul,酶为NEB公司产品。

酶切前.jpg



酶切后.jpg

[ Last edited by liurz on 2013-1-24 at 22:38 ]
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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★ ★ ★
liurz: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-01-26 23:01:25
引用回帖:
7楼: Originally posted by liurz at 2013-01-25 13:34:35
抱歉,补充一下,酶切体是50ul,昨天写错了。
酶切体系50ul,Xho I 和Not I各1ul(可以酶切2ug DNA),NEBbuffer 3加了5ul,纯化后目的基因30ul(三PCR管一起纯化得到),100×BSA 0.5ul,剩余无菌水补足50ul。37℃ ...

从胶上定量也需要你的带与marker相应的带亮度差不多啊,你的这个用眼睛直接估计有些难度。按照你的估计700ng是上了多少ul?
虽然不知道你的PCR扩增效率和回收效率,总之不一定要都切了吧。酶切后的一般是做连接,所需的DNA量是很少的,一般是低于100ng的。我认为你切1ug是足够的了。
15楼2013-01-25 14:46:45
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

酶切不完全。酶切完全时,片段之间的亮度比例应该与片段的大小成正比。
2楼2013-01-25 08:22:49
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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感谢参与,应助指数 +1
liurz: 金币+1, 有帮助 2013-01-25 14:31:11
感觉是酶切体系中质粒用量太大。你的质粒看起来浓度不错,20ul酶切体系里面你放了多少ug质粒?
3楼2013-01-25 08:34:07
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
liurz: 金币+1, 有帮助 2013-01-25 14:31:22
质粒的量过多,适当减少质粒
另外酶切体系可适当增大到40ul
4楼2013-01-25 08:55:25
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