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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求大神啊，双交换，筛突变株的时候出问题了。
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chuxuan

铜虫 (正式写手)

[求助] 求大神啊，双交换，筛突变株的时候出问题了。

要敲掉目的菌株染色体的一个基因。。。
用另外一个外源基因替换它。。。构建了一个敲出载体。（该载体，包含了要敲除的目的菌株基因的上下游臂，然后把这个外源基因和筛选标记连到上下游臂间，进行双交换）载体转化到特定的大肠中。
采用接合转移，做双交换，但长出来的菌，进行筛选的时候，都是大肠，没有我那株菌，到底是怎么回事呢。。。（做接合的时候，我在平板上有加一种可以杀大肠的，但大肠怎么还长呢，我有做对照，大肠在那种东西下是长不了的）
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1楼 2013-01-14 22:34:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你描述得有些混乱。
你的受体菌不是大肠杆菌？你是利用接合把构建好的质粒由大肠杆菌介导转入受体细胞吗？转化后筛选板上长得都是大肠杆菌？
会不会是平板上杀大肠杆菌的成分浓度低了，杀得不彻底？
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2楼2013-01-15 08:37:54
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chuxuan

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-15 08:37:54
你描述得有些混乱。
你的受体菌不是大肠杆菌？你是利用接合把构建好的质粒由大肠杆菌介导转入受体细胞吗？转化后筛选板上长得都是大肠杆菌？
会不会是平板上杀大肠杆菌的成分浓度低了，杀得不彻底？

我的供体菌是大肠（载体转化到大肠的），受体菌是一株光合细菌。您说得浓度低了，应该是不会的。。我有从做接合长出来的，挑到含有杀大肠的平板上养过，它是长不了的。。但直接挑到没有杀大肠药物的固体LB平板上，它就哗啦哗啦的给长出来的了。。。
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3楼2013-01-15 10:22:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

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3楼: Originally posted by chuxuan at 2013-01-15 10:22:37
我的供体菌是大肠（载体转化到大肠的），受体菌是一株光合细菌。您说得浓度低了，应该是不会的。。我有从做接合长出来的，挑到含有杀大肠的平板上养过，它是长不了的。。但直接挑到没有杀大肠药物的固体LB平板上， ...

我也做一些接合转移。有时候就是在转化的平板上除了受体菌以外还会有大肠杆菌的污染。这样很头疼，一般是要划线N次才能清除干净。不太清楚为什么你的受体菌没有长。可能是没有接合成功吧。试试再转一次看。
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4楼2013-01-15 11:29:09
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chuxuan

铜虫 (正式写手)
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4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-15 11:29:09
我也做一些接合转移。有时候就是在转化的平板上除了受体菌以外还会有大肠杆菌的污染。这样很头疼，一般是要划线N次才能清除干净。不太清楚为什么你的受体菌没有长。可能是没有接合成功吧。试试再转一次看。...

我坚持不懈的做了半学期。。。就是没做出来。。。头很大。。。有时候长出来的接合子，我挑了3 4百个，就都是大肠。。。很是郁闷。。难道受体菌都死翘翘了。。。您的接合转移的方法能否发给我参考下。。。会不会方法有问题。。。。。
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5楼2013-01-15 15:24:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励积极帮助解决问题 2013-01-16 13:42:37
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5楼: Originally posted by chuxuan at 2013-01-15 15:24:57
我坚持不懈的做了半学期。。。就是没做出来。。。头很大。。。有时候长出来的接合子，我挑了3 4百个，就都是大肠。。。很是郁闷。。难道受体菌都死翘翘了。。。您的接合转移的方法能否发给我参考下。。。会不会方法 ...

我转的是蓝藻，克隆是绿的。所以不会发生你说的情况。不知道对你的有没有帮助。
大致的方法如下：
把受体菌、含有克隆载体的e.coli，还有一个带有helper质粒的e.coli混起来。先是把helper菌和有载体的菌离心，用无抗生素的LB重悬，浓缩5-10倍，1:1混合。然后把生长在对数期的受体细胞也离心，重悬在BG-11培养液里，稀释若干梯度。最后把混合的菌液与受体细胞1:1混起来，30度1-2小时，然后涂在有微孔滤膜的平板（无抗生素）上培养1-2天，然后把滤膜转到抗性平板上筛选。
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6楼2013-01-15 15:53:49
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chuxuan

铜虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-15 15:53:49
我转的是蓝藻，克隆是绿的。所以不会发生你说的情况。不知道对你的有没有帮助。
大致的方法如下：
把受体菌、含有克隆载体的e.coli，还有一个带有helper质粒的e.coli混起来。先是把helper菌和有载体的菌离心，用 ...

谢谢啦。。。方法差不多。。。真不知道哪出问题了。。。你做藻基因工程的？博士？
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7楼2013-01-16 09:30:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by chuxuan at 2013-01-16 09:30:21
谢谢啦。。。方法差不多。。。真不知道哪出问题了。。。你做藻基因工程的？博士？...

做藻和植物的分子、生化，博后。
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8楼2013-01-16 09:33:12
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chuxuan

铜虫 (正式写手)
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8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-16 09:33:12
做藻和植物的分子、生化，博后。...

牛人啊。。。能否给个联系方式。。。可以交流下。
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9楼2013-01-16 09:36:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

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9楼: Originally posted by chuxuan at 2013-01-16 09:36:36
牛人啊。。。能否给个联系方式。。。可以交流下。...

email我吧，cicelyzhang@hotmail.com
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10楼2013-01-16 09:45:45
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