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求大神啊，双交换，筛突变株的时候出问题了。
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要敲掉目的菌株染色体的一个基因。。。 用另外一个外源基因替换它。。。构建了一个敲出载体。（该载体，包含了要敲除的目的菌株基因的上下游臂，然后把这个外源基因和筛选标记连到上下游臂间，进行双交换）载体转化到特定的大肠中。 采用接合转移，做双交换，但长出来的菌，进行筛选的时候，都是大肠，没有我那株菌，到底是怎么回事呢。。。（做接合的时候，我在平板上有加一种可以杀大肠的，但大肠怎么还长呢，我有做对照，大肠在那种东西下是长不了的） |
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2楼2013-01-15 08:37:54
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【答案】应助回帖
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gyesang: 金币+2, 鼓励积极帮助解决问题 2013-01-16 13:42:37
gyesang: 金币+2, 鼓励积极帮助解决问题 2013-01-16 13:42:37
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我转的是蓝藻，克隆是绿的。所以不会发生你说的情况。不知道对你的有没有帮助。 大致的方法如下： 把受体菌、含有克隆载体的e.coli，还有一个带有helper质粒的e.coli混起来。先是把helper菌和有载体的菌离心，用无抗生素的LB重悬，浓缩5-10倍，1:1混合。然后把生长在对数期的受体细胞也离心，重悬在BG-11培养液里，稀释若干梯度。最后把混合的菌液与受体细胞1:1混起来，30度1-2小时，然后涂在有微孔滤膜的平板（无抗生素）上培养1-2天，然后把滤膜转到抗性平板上筛选。 |
6楼2013-01-15 15:53:49
7楼2013-01-16 09:30:21
cicelyzh
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