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chuxuan

铜虫 (正式写手)

[求助] 求大神啊,双交换,筛突变株的时候出问题了。

要敲掉目的菌株染色体的一个基因。。。
用另外一个外源基因替换它。。。构建了一个敲出载体。(该载体,包含了要敲除的目的菌株基因的上下游臂,然后把这个外源基因和筛选标记连到上下游臂间,进行双交换)载体转化到特定的大肠中。
采用接合转移,做双交换,但长出来的菌,进行筛选的时候,都是大肠,没有我那株菌,到底是怎么回事呢。。。(做接合的时候,我在平板上有加一种可以杀大肠的,但大肠怎么还长呢,我有做对照,大肠在那种东西下是长不了的)
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励积极帮助解决问题 2013-01-16 13:42:37
引用回帖:
5楼: Originally posted by chuxuan at 2013-01-15 15:24:57
我坚持不懈的做了半学期。。。就是没做出来。。。头很大。。。有时候长出来的接合子,我挑了3 4百个,就都是大肠。。。很是郁闷。。难道受体菌都死翘翘了。。。您的接合转移的方法能否发给我参考下。。。会不会方法 ...

我转的是蓝藻,克隆是绿的。所以不会发生你说的情况。不知道对你的有没有帮助。
大致的方法如下:
把受体菌、含有克隆载体的e.coli,还有一个带有helper质粒的e.coli混起来。先是把helper菌和有载体的菌离心,用无抗生素的LB重悬,浓缩5-10倍,1:1混合。然后把生长在对数期的受体细胞也离心,重悬在BG-11培养液里,稀释若干梯度。最后把混合的菌液与受体细胞1:1混起来,30度1-2小时,然后涂在有微孔滤膜的平板(无抗生素)上培养1-2天,然后把滤膜转到抗性平板上筛选。
6楼2013-01-15 15:53:49
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你描述得有些混乱。
你的受体菌不是大肠杆菌?你是利用接合把构建好的质粒由大肠杆菌介导转入受体细胞吗?转化后筛选板上长得都是大肠杆菌?
会不会是平板上杀大肠杆菌的成分浓度低了,杀得不彻底?
2楼2013-01-15 08:37:54
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chuxuan

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-15 08:37:54
你描述得有些混乱。
你的受体菌不是大肠杆菌?你是利用接合把构建好的质粒由大肠杆菌介导转入受体细胞吗?转化后筛选板上长得都是大肠杆菌?
会不会是平板上杀大肠杆菌的成分浓度低了,杀得不彻底?

我的供体菌是大肠(载体转化到大肠的),受体菌是一株光合细菌。您说得浓度低了,应该是不会的。。我有从做接合长出来的,挑到含有杀大肠的平板上养过,它是长不了的。。但直接挑到没有杀大肠药物的固体LB平板上,它就哗啦哗啦的给长出来的了。。。
3楼2013-01-15 10:22:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by chuxuan at 2013-01-15 10:22:37
我的供体菌是大肠(载体转化到大肠的),受体菌是一株光合细菌。您说得浓度低了,应该是不会的。。我有从做接合长出来的,挑到含有杀大肠的平板上养过,它是长不了的。。但直接挑到没有杀大肠药物的固体LB平板上, ...

我也做一些接合转移。有时候就是在转化的平板上除了受体菌以外还会有大肠杆菌的污染。这样很头疼,一般是要划线N次才能清除干净。不太清楚为什么你的受体菌没有长。可能是没有接合成功吧。试试再转一次看。
4楼2013-01-15 11:29:09
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