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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 测定总氮
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wwdxx2004

金虫 (正式写手)

[求助] 测定总氮

请问各位是怎么测定发酵液中的总氮的？用的滤液还是发酵液？如果用滤液测定总氮的话，只能测定出溶液的氮（包括无机氮和有机氮）；若以测定发酵液，用凯氏定氮方法测定的话，则会测定出菌体中的氮，结果也不准确（经过测定，在整个发酵过程中以这种方法测定，总氮量几乎不变）。请问要想测出菌体对于总氮的利用情况要怎么测定？
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1楼 2013-01-12 15:18:27
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tpFlexin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+5, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-12 19:02:56
wwdxx2004: 金币+1 2013-01-14 08:27:33
α-氨基氮测定试剂的配制及测定方法
一、测定试剂的制备
A、测定试剂A的配制，拟定配制1000ml。
将0.671gOPA（邻苯二甲醛）溶解于100ml95%的乙醇。
将3.837gNaOH，8.468g硼酸，0.816gNAC（N-乙酰半胱氨酸）用800ml去离子水溶解，并将含OPA的100ml乙醇溶液与之混合后定容到1000ml。
B、测定试剂B的配制，拟定配制1000ml。
将3.837gNaOH，8.468g硼酸，0.816gNAC（N-乙酰半胱氨酸）用800ml去离子水溶解后与100ml95%的乙醇混合，并用去离子水定容到1000ml。
        以上溶液可以放在4摄氏度下存放两周。样品液中氨基N的浓度应该稀释到250mg/L的范围内，以确保测得数据的准确性。
二、样品液的制备
1．空白样，将50ul水加入洁净的15ml离心管中，加入3ml的A液用作为零点。
2．样品，将50ul样品液加入洁净的离心管，加入3mlA液混匀，10分钟后测其在335nm下的吸光值。
3．样品空白，取50ul的样品液加入洁净的离心管，加入3mlB液混匀10分钟后测量其335nm下的吸光值。
三、标准曲线的制作
配制10mM的异亮氨酸的标准溶液（0.328g异亮氨酸用去离子水溶解并定容到250ml）。
基本氨基酸态氮的标准曲线和计算

Tube        blank        1        2        3        4        5
10 mM ile (µL)        0        10        20        30        40        50
去离子水 (µL)        50        40        30        20        10        0
OPA reagent (µL)        3000        3000        3000        3000        3000        3000
Absorbance 335nm                                               
Nitrogen (mg/L)        0        28        56        84        112        140
       
        A（净）=A（样品）-A（样品空白）
四、计算
样品中氨基N的浓度：
       Nitrogen (mg/L)= (Absorbance * Slope + Intercept) * Dilution Factor

这是我们实验室发酵过程中测氮的方法，仅供参考
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2楼2013-01-12 16:08:32
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tpFlexin

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tpFlexin at 2013-01-12 16:08:32
α-氨基氮测定试剂的配制及测定方法
一、测定试剂的制备
A、测定试剂A的配制，拟定配制1000ml。
将0.671gOPA（邻苯二甲醛）溶解于100ml95%的乙醇。
将3.837gNaOH，8.468g硼酸，0.816gNAC（N-乙酰半胱氨酸）用80 ...

补充下，我们测的是有机N，主要是氨基酸的消耗，取的是发酵液离心后的上清
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3楼2013-01-12 16:16:17
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wgy2007

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wwdxx2004: 金币+1 2013-01-14 08:27:41
wwdxx2004: 金币+1 2013-02-20 12:50:28
用凯氏定氮法测离心后清液的总氮
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4楼2013-01-13 10:30:27
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wwdxx2004

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wgy2007 at 2013-01-13 10:30:27
用凯氏定氮法测离心后清液的总氮

这样的话测出来的只是溶解了的氮，不溶解的怎么办？
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5楼2013-01-14 08:31:25
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wgy2007

木虫 (小有名气)
有不溶解的氮源就不好测了，它很难跟菌分离开，是否可以试用可溶性的氮源加到培养基中，如酵母抽提物、蛋白胨等
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6楼2013-01-14 12:23:11
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yuyuwuxin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wwdxx2004: 金币+1 2013-02-20 12:50:33
国标过硫酸钾消解法，我们实验室都是这样测的
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7楼2013-01-14 16:48:59
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satisfyme

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yuyuwuxin at 2013-01-14 16:48:59
国标过硫酸钾消解法，我们实验室都是这样测的

我用国标碱性过硫酸钾法测定时，都是可溶性氮，为什么测出的数据基本没有变化呢
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8楼2013-01-17 15:46:58
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yuyuwuxin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by satisfyme at 2013-01-17 15:46:58
我用国标碱性过硫酸钾法测定时，都是可溶性氮，为什么测出的数据基本没有变化呢...

数据没有变化，是什么意思？你测得OD220一般多大？
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9楼2013-01-18 12:43:31
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xiefl1984

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wwdxx2004: 金币+1 2013-02-20 12:50:52
应该是离心或过滤后取发酵上清进行测定的吧
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10楼2013-01-18 13:34:48
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