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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

[求助] 酵母基因敲除回补实验

在用同源重组的方法把酵母的某个基因敲除以后，怎样做这个基因的回补实验？是用另外一个抗性基因连接同源片段和目的基因再次转入被敲除掉的酵母菌株内么？
如：上游同源+目的基因+新抗性+下游同源？是这样构建载体么？同源重组会不会因为两个片段的长度差异比较大而降低呢？
求高手详细解释实验原理和方法，谢谢！
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姥姥不疼，舅舅不爱
1楼2013-01-07 12:00:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般不能整合在同一位置，否则不能说明是否有位置效应。有两个办法来做，一个是整合到染色体上其它的某个位置上。一个是表达在质粒上。随便哪个都可以说明问题。
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2楼2013-01-07 14:03:53
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-07 14:03:53
一般不能整合在同一位置，否则不能说明是否有位置效应。有两个办法来做，一个是整合到染色体上其它的某个位置上。一个是表达在质粒上。随便哪个都可以说明问题。

那如果说我不关心位置效应的话，是不是就可以按照我说的那样做？换一个抗性再交换回去？
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姥姥不疼，舅舅不爱
3楼2013-01-07 14:59:05
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-07 14:03:53
一般不能整合在同一位置，否则不能说明是否有位置效应。有两个办法来做，一个是整合到染色体上其它的某个位置上。一个是表达在质粒上。随便哪个都可以说明问题。

还有就是，用我说的这种方法，换一个抗性连基因，重组回同一个位置以后，一般来说，能不能实验基因功能的完全恢复？包括位置效应。
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姥姥不疼，舅舅不爱
4楼2013-01-07 15:17:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 咆哮的白菜 at 2013-01-07 15:17:36
还有就是，用我说的这种方法，换一个抗性连基因，重组回同一个位置以后，一般来说，能不能实验基因功能的完全恢复？包括位置效应。...

你是可以用你说的方法。实验上也不应该有障碍。除非你的目的基因+新抗性基因非常大。如果你已经验证了你的突变株的5’端基因和3'端基因的表达不受影响，说明突变位置只影响到目的基因。我认为应该可以恢复基因功能的。
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5楼2013-01-08 08:07:51
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-07 14:03:53
一般不能整合在同一位置，否则不能说明是否有位置效应。有两个办法来做，一个是整合到染色体上其它的某个位置上。一个是表达在质粒上。随便哪个都可以说明问题。

如果按这两个方法来做的话，第一种是找一个多拷贝基因，构建片段做一次同源重组，交换到一个拷贝上？ 第二种的质粒该怎么选择，是随便有酵母启动子的质粒就可以么？
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姥姥不疼，舅舅不爱
6楼2013-01-09 11:38:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
咆哮的白菜: 金币+5, ★★★很有帮助, 非常感谢！ 2013-01-10 17:42:01
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6楼: Originally posted by 咆哮的白菜 at 2013-01-09 11:38:58
如果按这两个方法来做的话，第一种是找一个多拷贝基因，构建片段做一次同源重组，交换到一个拷贝上？ 第二种的质粒该怎么选择，是随便有酵母启动子的质粒就可以么？...

第一个办法是整合到一个没什么用的位置（neutral site），一般有研究这方面的。质粒上的话就是可以在酵母中复制的质粒，前面挂上一个酵母的强启动子，或者是基因自身的启动子。
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7楼2013-01-09 12:04:02
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-09 12:04:02
第一个办法是整合到一个没什么用的位置（neutral site），一般有研究这方面的。质粒上的话就是可以在酵母中复制的质粒，前面挂上一个酵母的强启动子，或者是基因自身的启动子。...

谢谢，最后一问，能给一篇第一种方法的文献么？谢谢！
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姥姥不疼，舅舅不爱
8楼2013-01-10 17:42:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 咆哮的白菜 at 2013-01-10 17:42:31
谢谢，最后一问，能给一篇第一种方法的文献么？谢谢！...

我不做酵母，做藻和植物的，所以没有你要的酵母文献。
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9楼2013-01-11 08:31:19
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-11 08:31:19
我不做酵母，做藻和植物的，所以没有你要的酵母文献。...

好吧，谢谢你
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姥姥不疼，舅舅不爱
10楼2013-01-11 14:51:31
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