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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DNA测序
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hlwnxfd2011

银虫 (小有名气)

[求助] DNA测序

请教一下各位前辈：是这样的，前几天送了两个样去测序公司，给的测序结果却是载体序列，也就是我的目的基因没有连到载体上，但我在做TA克隆时，用了蓝白斑筛选，并做了PCR鉴定，都是阳性，现在不知原因，请知道的前辈不吝赐教，感激不尽。
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1楼 2012-12-29 21:24:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hlwnxfd2011: 金币+2, ★有帮助 2012-12-31 15:10:28
蓝白斑筛和PCR都可能出现假阳性，最好提一下质粒做酶切鉴定再送去测序。
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2楼2012-12-30 02:25:16
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hlwnxfd2011: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-12-31 15:10:45
个人认为蓝白斑可以不做，基本上不能反映任何情况。可以选择酶切系统验证一下，最好是序列上有一个切点，载体片段上有另一个位点。pcr鉴定的话我一般都不会选择先前做pcr克隆序列时的引物，而是在序列中段设计一条新引物，这样还能得到理论上大小的片段的话，应该基本可以说是阳性。因为如果还使用原来的引物做，不管你得到的是不是目的片段都还是能检测到与原来p到条带一样大小的一个条带。
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3楼2012-12-30 14:19:37
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hlwnxfd2011: 金币+2, ★有帮助 2012-12-31 15:10:56
提质粒看一下大小，差不多的再做测序。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2012-12-30 15:54:50
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hlwnxfd2011

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by junior850621 at 2012-12-30 14:19:37
个人认为蓝白斑可以不做，基本上不能反映任何情况。可以选择酶切系统验证一下，最好是序列上有一个切点，载体片段上有另一个位点。pcr鉴定的话我一般都不会选择先前做pcr克隆序列时的引物，而是在序列中段设计一条新 ...

谢谢您的指点。
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5楼2012-12-31 15:11:43
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hlwnxfd2011

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-30 15:54:50
提质粒看一下大小，差不多的再做测序。

谢谢您的指点。
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6楼2012-12-31 15:12:01
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hlwnxfd2011

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-30 02:25:16
蓝白斑筛和PCR都可能出现假阳性，最好提一下质粒做酶切鉴定再送去测序。

谢谢您的指点。
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7楼2012-12-31 15:12:21
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cdmmore

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我最近也遇到相同的问题，PCR检测是阳性，但测序却是空质粒。建议提质粒酶切鉴定，正确的再送去测序，这样更靠谱
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8楼2012-12-31 16:35:43
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