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hlwnxfd2011

银虫 (小有名气)

[求助] DNA测序

请教一下各位前辈:是这样的,前几天送了两个样去测序公司,给的测序结果却是载体序列,也就是我的目的基因没有连到载体上,但我在做TA克隆时,用了蓝白斑筛选,并做了PCR鉴定,都是阳性,现在不知原因,请知道的前辈不吝赐教,感激不尽。
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hlwnxfd2011

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by junior850621 at 2012-12-30 14:19:37
个人认为蓝白斑可以不做,基本上不能反映任何情况。可以选择酶切系统验证一下,最好是序列上有一个切点,载体片段上有另一个位点。pcr鉴定的话我一般都不会选择先前做pcr克隆序列时的引物,而是在序列中段设计一条新 ...

谢谢您的指点。
5楼2012-12-31 15:11:43
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查看全部 8 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
hlwnxfd2011: 金币+2, 有帮助 2012-12-31 15:10:28
蓝白斑筛和PCR都可能出现假阳性,最好提一下质粒做酶切鉴定再送去测序。
2楼2012-12-30 02:25:16
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
hlwnxfd2011: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-12-31 15:10:45
个人认为蓝白斑可以不做,基本上不能反映任何情况。可以选择酶切系统验证一下,最好是序列上有一个切点,载体片段上有另一个位点。pcr鉴定的话我一般都不会选择先前做pcr克隆序列时的引物,而是在序列中段设计一条新引物,这样还能得到理论上大小的片段的话,应该基本可以说是阳性。因为如果还使用原来的引物做,不管你得到的是不是目的片段都还是能检测到与原来p到条带一样大小的一个条带。
3楼2012-12-30 14:19:37
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
hlwnxfd2011: 金币+2, 有帮助 2012-12-31 15:10:56
提质粒看一下大小,差不多的再做测序。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2012-12-30 15:54:50
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