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笑笑2697

铁虫 (小有名气)

[求助] 蛋白表达

我截取催化活性部分的基因对其进行表达，为什么截取的小片段基因不表达呢？
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1楼 2012-12-10 08:26:48
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
也许是蛋白不稳定呢，表达但是降解了，太小的蛋白是不太稳定的，还有一个N端氨基酸规则。
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2012-12-10 10:13:29
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sdgxz

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以看一下08年nature上的这篇文章：Protein production and purification
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3楼2012-12-10 15:37:25
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笑笑2697

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2012-12-10 10:13:29
也许是蛋白不稳定呢，表达但是降解了，太小的蛋白是不太稳定的，还有一个N端氨基酸规则。

我的蛋白7、8kd。如果降解的话应该怎么避免降解呢？N端氨基酸规则具体指的是什么呢~
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4楼2012-12-10 20:46:47
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post_ngao

木虫 (正式写手)

科研宅

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
笑笑2697: 金币+1, ★有帮助 2012-12-10 22:18:15
情报太少了，很难判断。有可能是质粒构建的问题；有可能是宿主的问题；也有可能是表达的问题。不知楼主用的是什么质粒，什么宿主，什么条件。7-8kd确实不太大，不过如果宿主选择的没问题，表达条件都正确的话应该不至于被降解。如果担心降解可以在培养基中加入蛋白酶抑制剂，比如PMSF什么的。
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天命所归，各安其位
5楼2012-12-10 21:51:40
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笑笑2697

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by post_ngao at 2012-12-10 21:51:40
情报太少了，很难判断。有可能是质粒构建的问题；有可能是宿主的问题；也有可能是表达的问题。不知楼主用的是什么质粒，什么宿主，什么条件。7-8kd确实不太大，不过如果宿主选择的没问题，表达条件都正确的话应该不 ...

pcold1,  E.coli   根据楼上的解答，我觉得应该是N端规则引起的~
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6楼2012-12-10 22:17:31
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带头大哥

铁虫 (小有名气)
同问，氮端氨基酸规则是啥
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为家人为自己，努力
7楼2012-12-14 11:24:44
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笑笑2697

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 带头大哥 at 2012-12-14 11:24:44
同问，氮端氨基酸规则是啥

蛋白质在大肠杆菌中表达出来以后，第一步是切掉N端的甲硫氨酸（Met），这一步酶解反应由methionyl aminopeptidase这个酶完成。假设N端Met的位置是+1，当+2位置的氨基酸拥有一个大的侧链时该酶解反应则比较慢。Tobias et al（1991）发现了蛋白质细菌中保持稳定的“N端法则”。当蛋白质N端为Arg、Lys、Phe、Leu、Trp、Tyr 这几种氨基酸时，该蛋白质在细菌细胞中的“半衰期”一般小于2分钟；当蛋白质N端为其余别的氨基酸时，该蛋白质在细菌体内的“半衰期”一般大于10个小时。
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8楼2012-12-16 11:57:18
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带头大哥

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 笑笑2697 at 2012-12-16 11:57:18
蛋白质在大肠杆菌中表达出来以后，第一步是切掉N端的甲硫氨酸（Met），这一步酶解反应由methionyl aminopeptidase这个酶完成。假设N端Met的位置是+1，当+2位置的氨基酸拥有一个大的侧链时该酶解反应则比较慢。Tobi ...

这个和蛋白质大小有关系么，我第一次听说N端规则，是Met后面那个不能为Arg、Lys、Phe、Leu、Trp、Tyr ？
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为家人为自己，努力
9楼2012-12-18 14:03:26
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笑笑2697

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 带头大哥 at 2012-12-18 14:03:26
这个和蛋白质大小有关系么，我第一次听说N端规则，是Met后面那个不能为Arg、Lys、Phe、Leu、Trp、Tyr ？...

你可以查查文献，和大小没关系，只是N端第一个Met后不能为那些氨基酸~
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10楼2012-12-20 09:35:51
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