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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 干涉载体构建
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fuyin

新虫 (初入文坛)

[求助] 干涉载体构建

为什么在构建干涉载体时总是连接上一边后另外一边掉了，我做了很久了，每次都是正向片段连接上后连接反向片段时正向片段不见了。这是为什么呢？？谢谢！！！
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1楼 2012-11-17 22:51:43
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
能不能说下你的具体构建过程啊？你的方法好像很特殊的样子
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2012-11-18 15:14:54
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
求构建过程真相。。。。
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jiayoubashaonian
3楼2012-11-18 15:39:51
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fuyin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2012-11-18 15:14:54
能不能说下你的具体构建过程啊？你的方法好像很特殊的样子

先用两个酶来酶切载体一端，回收大片段后与所需片段连接。转化鉴定后，以连接了一个片段的干涉载体再做酶切，切去另外一端，胶回收后（此时已经有我连接的一个片段），再与所需片段连接，转化后鉴定时结果只有第二次连接的片段，第一次的没有了！
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4楼2012-11-18 20:55:03
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fuyin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-11-18 15:39:51
求构建过程真相。。。。

先用两个酶来酶切载体一端，回收大片段后与所需片段连接。转化鉴定后，以连接了一个片段的干涉载体再做酶切，切去另外一端，胶回收后（此时已经有我连接的一个片段），再与所需片段连接，转化后鉴定时结果只有第二次连接的片段，第一次的没有了！
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5楼2012-11-18 20:56:13
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by fuyin at 2012-11-18 20:56:13
先用两个酶来酶切载体一端，回收大片段后与所需片段连接。转化鉴定后，以连接了一个片段的干涉载体再做酶切，切去另外一端，胶回收后（此时已经有我连接的一个片段），再与所需片段连接，转化后鉴定时结果只有第二 ...

你连的多长的片段，你酶切的时候，是不是每次都是单酶切位点？
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2012-11-18 22:00:01
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fuyin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2012-11-18 22:00:01
你连的多长的片段，你酶切的时候，是不是每次都是单酶切位点？...

大约750bp，就是每次都是两个不同的酶啊！
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7楼2012-11-20 19:41:37
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天空2011

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
要是实验室不缺经费的话，推荐你用Gateway®LR Clonase II Enzyme Mix，这个试剂盒很方便，一步就将两个片段连上了。
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8楼2012-11-20 20:31:07
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polepolar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可能是整个发卡结构的臂太长了，导致质粒在复制过程中受到影响。
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北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
9楼2012-11-21 01:01:52
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