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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助高手指点有关基因敲除
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qianxun24

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助高手指点有关基因敲除

我目前在做基因敲除，是有关II型内含子插入失活的，现在做到验证这一步，但是一直验证不出到底有没有插入失活，我是用一种抗生素筛选，按理说在这种抗生素上能长出来的就应该有插入失活的（即，被敲除的），但是挑了40多个菌，菌落PCR验证后都没有PCR出现我要的片段（其实是核酸电泳后没有出现任何条带），我是想问，一般敲除是要挑很多单菌落验证吗？还有没有其他比较好的验证方法，跪求指点。
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1楼 2012-11-17 14:40:03
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1514132

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
qianxun24: 金币+5, ★有帮助 2012-11-24 09:20:58
建议你做一下表达量的区分，比如半定量

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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qianxun24
2楼2012-11-23 16:08:03
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
qianxun24: 金币+5, ★有帮助 2012-11-24 09:13:24
你PCR带了阳性对照没？看看阳性对照有没有P出来
还有就是菌落PCR能够扩增的长度有限，好像2K以上的片段用菌落PCR就有点悬了，倒不如提取基因组DNA来PCR试试
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qianxun24
3楼2012-11-23 17:22:23
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qianxun24

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-23 17:22:23
你PCR带了阳性对照没？看看阳性对照有没有P出来
还有就是菌落PCR能够扩增的长度有限，好像2K以上的片段用菌落PCR就有点悬了，倒不如提取基因组DNA来PCR试试

阳性对照是1300bp的片段，每次都能P出来，目标片段是900bp，菌落PCR我估计做了200多个了，目前还是P不出来。我用的是红霉素筛选插入失活的，按理活插入了才能在红霉素抗性上长出来，有没有可能是插入到其它片段了呢？
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4楼2012-11-24 09:18:49
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qianxun24

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 1514132 at 2012-11-23 16:08:03
建议你做一下表达量的区分，比如半定量

什么是表达量的区分，我是个新手，对这块还不是太熟悉，能跟我详细说下嘛，不胜感激！
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5楼2012-11-24 09:20:40
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1514132

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
qianxun24: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-11-24 09:32:48
引用回帖:
5楼: Originally posted by qianxun24 at 2012-11-24 09:20:40
什么是表达量的区分，我是个新手，对这块还不是太熟悉，能跟我详细说下嘛，不胜感激！...

就是做个real-time PCR相对定量 ，或者跑凝胶电泳做一个半定量。
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6楼2012-11-24 09:27:27
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qianxun24

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 1514132 at 2012-11-24 09:27:27
就是做个real-time PCR相对定量 ，或者跑凝胶电泳做一个半定量。...

好的我试试，谢谢你的建议
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7楼2012-11-24 09:32:37
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lxd19861216

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
qianxun24: 金币+2, ★有帮助 2012-11-26 14:04:47
不知道你这个基因敲除的原理是什么？我们实验室有一个做基因敲除的，遗传很不稳定，菌落pcr时有时无，都不知道怎么回事。我觉得应该把原理好好看看。
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8楼2012-11-26 14:00:48
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qianxun24

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lxd19861216 at 2012-11-26 14:00:48
不知道你这个基因敲除的原理是什么？我们实验室有一个做基因敲除的，遗传很不稳定，菌落pcr时有时无，都不知道怎么回事。我觉得应该把原理好好看看。

原理没有问题，你们实验室的时有时无说明总归是有的，我的菌落PCR从来都没有过，哎
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9楼2012-11-26 14:06:35
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