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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 电转时电压上不去
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chjinzhi

银虫 (正式写手)

[求助] 电转时电压上不去

我现在在做Bt的电击转化，用的菌株是BMB171，感受态用SG缓冲液洗涤并保存。电击时加1mg左右的质粒，电击仪是eppendorf的，电击设定压力是2500v，但在实际运行中，电压只有680v左右，怎么改都没有效果。OD值的变化也没有用。OD在0.6-0.8和1.2-1.5之间的实际电转电压都在680v左右。谁能告诉我到底是哪里出了问题？或者要从哪些方面验证试验。万分感谢呀！
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1楼 2012-11-15 12:05:49
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-19 13:45:47
什么是SG缓冲液啊？我只用过Bio-Rad的仪器。电压上不去会不会是样品中有盐，产生电弧了？我的感受态都是最后用水或者极低离子强度的无盐缓冲液洗涤三次做电转化的。还有，有点惊讶用1mg质粒什么的，质粒用量不是应该pg级的吗？
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2楼2012-11-15 13:29:28
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chjinzhi

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-15 13:29:28
什么是SG缓冲液啊？我只用过Bio-Rad的仪器。电压上不去会不会是样品中有盐，产生电弧了？我的感受态都是最后用水或者极低离子强度的无盐缓冲液洗涤三次做电转化的。还有，有点惊讶用1mg质粒什么的，质粒用量不是应该 ...

SG缓冲液就是272mM的蔗糖和15%的甘油。我培养细菌的培养基都是LB，而且洗涤了那么多次按理应该不会有盐离子的。我试过只电击感受态，电压也差不多，没多大变化。
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3楼2012-11-15 20:17:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

你可以试试直接电击你的SG缓冲液试下看电压是否可以上去。大肠杆菌的感受态也可以试试。此外，你加样品加到cuvette里面的时候是否完全到底部，是否有气泡？
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4楼2012-11-16 08:38:21
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huoyongting

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你说的OD0.6--0.8是做感受态之前的菌浓度还是电转的时候的菌浓度啊，我电转的时候菌浓度都有几十OD了，还有质粒浓度确实高的离谱啊，最多用过的100ng
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5楼2012-11-16 11:05:08
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chjinzhi

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-16 08:38:21
你可以试试直接电击你的SG缓冲液试下看电压是否可以上去。大肠杆菌的感受态也可以试试。此外，你加样品加到cuvette里面的时候是否完全到底部，是否有气泡？

我试过只电击我的缓冲液，电压在660v左右。我还单独电击过我的感受态，电压在685v左右。
加样的时候，我是轻轻的打入，沿着杯壁缓缓打进去的，所以没有气泡。
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6楼2012-11-17 10:22:40
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chjinzhi

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by huoyongting at 2012-11-16 11:05:08
你说的OD0.6--0.8是做感受态之前的菌浓度还是电转的时候的菌浓度啊，我电转的时候菌浓度都有几十OD了，还有质粒浓度确实高的离谱啊，最多用过的100ng

在做感受态之前的OD，测完OD，若OD符合马上就放入冰上冰浴10min，然后离心，洗涤3次到5次，然后加入200ul的缓冲液，进行后续的电击实验。
为什么质粒浓度不能那么高呀？我搜到的材料里，有的都5mg呢。
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7楼2012-11-17 10:26:36
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接用纯水试试吧，看看是不是仪器有什么毛病，不要只考虑实验，也要考虑实验仪器
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chjinzhi
8楼2012-11-17 11:46:47
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-19 13:46:00
引用回帖:
7楼: Originally posted by chjinzhi at 2012-11-17 10:26:36
在做感受态之前的OD，测完OD，若OD符合马上就放入冰上冰浴10min，然后离心，洗涤3次到5次，然后加入200ul的缓冲液，进行后续的电击实验。
为什么质粒浓度不能那么高呀？我搜到的材料里，有的都5mg呢。...

你确定不是仪器的问题吗？是否电转化其它感受态受体电压能上去吗？
还有，你知道5mg质粒有多少拷贝吗？一般做点高效率的感受态是大于10的八次方cfu/ug质粒DNA，质粒的用量是10pg-0.1ng。效率较差的受体（低于10的5次方）可以用到1-10ug。mg好像太夸张了吧，你确定要用那么多质粒吗？
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9楼2012-11-17 11:49:22
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chjinzhi

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 大海一孤舟 at 2012-11-17 11:46:47
直接用纯水试试吧，看看是不是仪器有什么毛病，不要只考虑实验，也要考虑实验仪器

我做过对照，纯水和SG的对照，电压也上不去。
在仪器方面，我打算近期试一下博乐的电击仪。希望能有所突破吧。
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10楼2012-11-18 09:53:01
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