24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 1568  |  回复: 14

chjinzhi

银虫 (正式写手)

[求助] 电转时电压上不去

我现在在做Bt的电击转化,用的菌株是BMB171,感受态用SG缓冲液洗涤并保存。电击时加1mg左右的质粒,电击仪是eppendorf的,电击设定压力是2500v,但在实际运行中,电压只有680v左右,怎么改都没有效果。OD值的变化也没有用。OD在0.6-0.8和1.2-1.5之间的实际电转电压都在680v左右。谁能告诉我到底是哪里出了问题?或者要从哪些方面验证试验。万分感谢呀!
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-19 13:45:47
什么是SG缓冲液啊?我只用过Bio-Rad的仪器。电压上不去会不会是样品中有盐,产生电弧了?我的感受态都是最后用水或者极低离子强度的无盐缓冲液洗涤三次做电转化的。还有,有点惊讶用1mg质粒什么的,质粒用量不是应该pg级的吗?
2楼2012-11-15 13:29:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chjinzhi

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-15 13:29:28
什么是SG缓冲液啊?我只用过Bio-Rad的仪器。电压上不去会不会是样品中有盐,产生电弧了?我的感受态都是最后用水或者极低离子强度的无盐缓冲液洗涤三次做电转化的。还有,有点惊讶用1mg质粒什么的,质粒用量不是应该 ...

SG缓冲液就是272mM的蔗糖和15%的甘油。我培养细菌的培养基都是LB,而且洗涤了那么多次按理应该不会有盐离子的。我试过只电击感受态,电压也差不多,没多大变化。
3楼2012-11-15 20:17:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

你可以试试直接电击你的SG缓冲液试下看电压是否可以上去。大肠杆菌的感受态也可以试试。此外,你加样品加到cuvette里面的时候是否完全到底部,是否有气泡?
4楼2012-11-16 08:38:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huoyongting

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你说的OD0.6--0.8是做感受态之前的菌浓度还是电转的时候的菌浓度啊,我电转的时候菌浓度都有几十OD了,还有质粒浓度确实高的离谱啊,最多用过的100ng
5楼2012-11-16 11:05:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chjinzhi

银虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-16 08:38:21
你可以试试直接电击你的SG缓冲液试下看电压是否可以上去。大肠杆菌的感受态也可以试试。此外,你加样品加到cuvette里面的时候是否完全到底部,是否有气泡?

我试过只电击我的缓冲液,电压在660v左右。我还单独电击过我的感受态,电压在685v左右。
加样的时候,我是轻轻的打入,沿着杯壁缓缓打进去的,所以没有气泡。
6楼2012-11-17 10:22:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chjinzhi

银虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by huoyongting at 2012-11-16 11:05:08
你说的OD0.6--0.8是做感受态之前的菌浓度还是电转的时候的菌浓度啊,我电转的时候菌浓度都有几十OD了,还有质粒浓度确实高的离谱啊,最多用过的100ng

在做感受态之前的OD,测完OD,若OD符合马上就放入冰上冰浴10min,然后离心,洗涤3次到5次,然后加入200ul的缓冲液,进行后续的电击实验。
为什么质粒浓度不能那么高呀?我搜到的材料里,有的都5mg呢。
7楼2012-11-17 10:26:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

大海一孤舟

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
直接用纯水试试吧,看看是不是仪器有什么毛病,不要只考虑实验,也要考虑实验仪器

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

8楼2012-11-17 11:46:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-19 13:46:00
引用回帖:
7楼: Originally posted by chjinzhi at 2012-11-17 10:26:36
在做感受态之前的OD,测完OD,若OD符合马上就放入冰上冰浴10min,然后离心,洗涤3次到5次,然后加入200ul的缓冲液,进行后续的电击实验。
为什么质粒浓度不能那么高呀?我搜到的材料里,有的都5mg呢。...

你确定不是仪器的问题吗?是否电转化其它感受态受体电压能上去吗?
还有,你知道5mg质粒有多少拷贝吗?一般做点高效率的感受态是大于10的八次方cfu/ug质粒DNA,质粒的用量是10pg-0.1ng。效率较差的受体(低于10的5次方)可以用到1-10ug。mg好像太夸张了吧,你确定要用那么多质粒吗?
9楼2012-11-17 11:49:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chjinzhi

银虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 大海一孤舟 at 2012-11-17 11:46:47
直接用纯水试试吧,看看是不是仪器有什么毛病,不要只考虑实验,也要考虑实验仪器

我做过对照,纯水和SG的对照,电压也上不去。
在仪器方面,我打算近期试一下博乐的电击仪。希望能有所突破吧。
10楼2012-11-18 09:53:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 chjinzhi 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 恳请有学校收留 +7 柯淮然 2026-04-12 7/350 2026-04-16 22:50 by cfdbai
[考研] 求调剂 +8 小聂爱学习 2026-04-16 10/500 2026-04-16 22:06 by 1shin_ichi
[考研] 0854求调剂 +21 门路摸摸 2026-04-15 24/1200 2026-04-16 21:24 by Art1977
[考研] 0831生医工第一轮调剂失败求助 +14 小熊睿睿_s 2026-04-11 18/900 2026-04-16 20:41 by lpl364211
[考研] 307中医考研调剂 +6 于以采蘩 2026-04-14 6/300 2026-04-16 16:20 by qingfeng258
[考研] 药学专硕调剂 +9 ? 一路生?花? 2026-04-10 11/550 2026-04-16 10:49 by noqvsozv
[考研] 药学求调剂 +11 RussHu 2026-04-12 13/650 2026-04-15 19:07 by zhuwenxu
[考研] 生物学调剂 +9 纸扇zhishan 2026-04-13 9/450 2026-04-15 18:28 by AN流800
[考研] 复试调剂 +21 积极向上; 2026-04-10 23/1150 2026-04-15 12:50 by 西北望—风沙
[考研] 272分材料子求调剂 +41 Loy0361 2026-04-10 54/2700 2026-04-14 18:00 by lhj2009
[考研] 271求调剂 +35 2261744733 2026-04-11 41/2050 2026-04-14 15:36 by zs92450
[考研] 一志愿哈工大 085600 277 12材科基求调剂 5+5 chenny174 2026-04-10 37/1850 2026-04-14 07:39 by Abskk
[考研] 297工科,求调剂? +13 河南农业大学-能 2026-04-12 13/650 2026-04-13 14:12 by dingyanbo1
[考研] 0854调剂 +10 长弓傲 2026-04-11 11/550 2026-04-13 10:38 by wp06
[考研] 调剂求助 +6 果然有我 2026-04-11 7/350 2026-04-11 16:22 by 明月此时有
[考研] 本人女孩 +7 吼吼, 2026-04-10 9/450 2026-04-11 14:45 by ACS Nano——
[考研] 0859,337求调剂 +4 研s. 2026-04-10 4/200 2026-04-11 11:34 by caotw2020
[考研] 0854调剂 +5 音像店听花鼓戏 2026-04-10 5/250 2026-04-11 10:49 by qingpingzhu
[考研] 346,工科0854求调剂,专硕 +7 moser233 2026-04-10 8/400 2026-04-11 08:52 by 猪会飞
[考研] 材料与化工调剂 +12 否极泰来2026 2026-04-10 13/650 2026-04-11 00:28 by wangjihu
信息提示
请填处理意见