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hraikeyan

金虫 (小有名气)

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[求助] 小片段基因文库构建中载体的选择

各位虫友：我现在需要构建一个细菌的基因文库。基因片段控制在2-6kb之间，是采用目标酶的活性进行筛选，筛选过程是在96孔板中进行的。我在一些文献中看到很多人构建文库都是采用puc19作为载体，然后转化到DH5α中，在平板上根据酶活筛选出目标克隆子。我的问题是：PUC19是克隆载体，以他为载体能表达出酶吗？以puc19为载体固然是好，它能进行蓝白斑筛选，这样可以节省很大一部分工作量，但是我实在96孔板中以酶活为评价标准筛，能用puc19载体吗？

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nothing isimpossible

1楼 2012-11-01 23:19:08

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hraikeyan

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引用回帖:

10楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-11-07 00:28:18
切胶后，不需要酚氯仿抽提，如果浓度可以的话，直接连接。...

您好：现在我在提基因组时就出问题了，我是用溶菌酶，蛋白酶K处理后，用异丙醇析出DNA，再用酚，氯仿抽提。上学期也做过这个菌的基因组提取，效果还挺好，可是最近连着做了三次，都没有做出来。三次的现象是这样的：
第一次：取4ml菌，在蛋白酶K处理后，离心，取上清，可是沉淀是很粘稠的一坨，吸不上来；最后在加入异丙醇后，没有丝状物出现（上次是有丝状物出现）。怀疑菌量太多。
第二次“取1.5ml菌，蛋白酶K处理后，溶液离心，一点都不粘稠，很容易就把上清分离出来，但是加入异丙醇后还是没有丝状物出现，只是变浑浊了，直到最后一步，也没有沉淀出现。
我一直怀疑是在溶菌酶处理，蛋白酶K处理时有问题，但都是按之前的步骤来的，怎么也提不出来。