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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 转染实验注意事项，为什么每次结果都不理想，阳性要有结果，样品的重复性却很差
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柔水i

新虫 (著名写手)

[求助] 转染实验注意事项，为什么每次结果都不理想，阳性要有结果，样品的重复性却很差

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【分子生物】EPI帖

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1楼 2012-10-26 08:48:26
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kakayh

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 热心的虫虫啊 2012-11-10 15:38:22
忘了说，我之前使用的96孔板，误差好大，重复性不好，现在使用6孔板或者60mm小皿，效果都很好细胞几乎不死。
还有一点，就是无血清培养基我一律使用opti-MEM，挺好用的。
我做之前差的，也许对你有用：     invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！
1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。（我的接种密度是3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）
3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）
4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。
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4楼2012-11-01 11:24:54
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448935271

银虫 (小有名气)
瞬转还是稳转啊
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万物皆有毒，只要剂量足
2楼2012-10-26 13:40:01
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kakayh

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-11-10 15:38:01
最近在做293T瞬转，效率蛮高的，可以跟你分享一下经验。使用的是LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）
1.首先细胞状态是最最重要的，转染时饱和度一定要90%以上，细胞形态比较好的时候做(一般传代3-4代时最好，不要急于求成)
2.细胞加DNA-lipo-2000复合物之前可以使用opti-MEM洗两遍，非常好用。
3.6小时后，更换含有血清的全培养基。
效果很好的啊 ，个人感觉还是细胞状态最重要，不要太满，挤的细胞都变形了也不好哦；太稀了容易死

祝你好运！
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3楼2012-11-01 11:15:22
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zzhwcz01

金虫 (小有名气)
学习了，非常感恩
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努力吧少年
5楼2012-11-10 14:53:33
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

转染条件需要优化的，可以到相关的试剂公司看看他们的试剂盒使用什么样子的细胞，Roche或者Invitrogen的都有针对特定细胞的试剂盒，可以到相关网站看看
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6楼2012-11-11 12:11:17
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柔水i

新虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kakayh at 2012-11-01 11:24:54
忘了说，我之前使用的96孔板，误差好大，重复性不好，现在使用6孔板或者60mm小皿，效果都很好细胞几乎不死。
还有一点，就是无血清培养基我一律使用opti-MEM，挺好用的。
我做之前差的，也许对你有用：     invit ...

我开始用24孔，现在想换96孔，为什么“96孔板，误差好大，重复性不好”，还有96孔一般种板的密度和体积是多少啊，还是只要保证细胞数就行，体积和密度的影响大吗？
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7楼2012-11-12 22:00:57
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chenximutao

金虫 (小有名气)
学习了~~~
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浮尘中的坚持弥足珍贵
8楼2013-01-05 17:18:41
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匿名

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9楼2022-04-18 22:50:15
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