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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » sds崩溃了，求解答
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huangyan0517

金虫 (小有名气)

[求助] sds崩溃了，求解答

我把步骤说的详细些：
溶液都是按分子克隆实验书上配的，30%丙烯酰胺混合液（29:1），1.5mol/，ph8.8的ltris，1mol/l ph6.8tris ，用1mol/l ph6.8tris配的上样buffer，5倍电泳缓冲液（15.1g tris，94g gly，5g sds，1000ml）。
配胶的过程：
用的伯乐mini 1mm电泳版，板洗干净之后夹好，晾干，用的时候直接用
分离胶15%，灌完分离胶，用蒸馏水封闭一下，大概1cm的高度
等大概20-30分钟，倒掉水，滤纸吸干，灌浓缩胶，插梳子，再过半小时拔梳子。
样品浓度比较高，大概17mg/ml，0.01M的PB溶液，之前是用20ul一倍上样buffer混合5ul样品，煮沸1min后上样，上样每孔20ul。
电泳条件为浓缩胶20min，分离胶50分钟。样品为溶菌酶及其多聚体混合物。
图如下，左边两条为自己做的marker，第一个为bsa，第二个为bsa和溶菌酶单体混合物。

目前问题如下：
（1）拔完梳子之后，胶孔会有一层薄膜，应该是梳子和板之间不紧密，有空隙产生的，但是梳子是配套的，每次都会有样品加不进去的情况，用针挑也跳不干净，各位有没有这种情况，怎么解决的？
（2）ph8.8和6.8的ph用浓盐酸调好之后，ph还会变化，会增加0.1-0.2的ph，即使调好之后，还是没有压缩效应。
（3）胶配好之后，把板夹到电泳槽上，灌满电泳缓冲液，几乎每次第一次都会漏液，第二次就不会，操作完全一样
(4)电泳缓冲液没调过ph，上次测了一下，1倍大概8.5，
（5）样品分子质量越大，拖尾月严重。
（6）0.01m pb离子强度影响很大吗

跪求高人解答

后面两个是跑的血清样品，浓缩胶5%，分离胶10%，其他条件基本和上面一直，手机拍的，不太清楚，拜托也给分析分析。

溶菌酶浓缩液.jpg



1.JPG



2.JPG
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时间在哪里，成就就在哪里
1楼 2012-10-22 10:45:16
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huangyan0517

金虫 (小有名气)
后面两个都是血清，上样都一样，一次跑了两块板
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时间在哪里，成就就在哪里
4楼2012-10-22 12:03:06
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查看全部 9 个回答

huangyan0517

金虫 (小有名气)
另外，跑电泳的过程中溴酚蓝是压得很细吗，我的一半都很粗，而且泳道之间会连接起来
赞一下 回复此楼
时间在哪里，成就就在哪里
2楼2012-10-22 10:52:00
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longway102

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
发现两个图一样啊，是不是设置没弄好
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3楼2012-10-22 11:14:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-22 13:42:33
Tris缓冲液的pH非常重要，否则条带不sharp。调pH时加浓盐酸接近所需pH，令其冷却至室温后再慢慢用1N盐酸调。电泳液不必调pH，本身就是用的Tris-glycine缓冲体系。
胶在20分钟内凝可能有些快，一般是30-60分钟凝为宜。凝胶速度过快会造成孔径不均一。
为了减少电泳液漏的问题，可以在安装电泳装置时用1×的电泳液润湿玻璃短板和所夹电极板。
如果你觉得样品浓缩不好，可以适当加长浓缩胶，小胶大约1cm应该可以了。
感觉上样量有点大。不是说不行，但想要很sharp的条带，最好上样量减半。顺便问一下，你上样前是否对样品做了离心？
磷酸缓冲液对跑SDS胶有点影响，但10mM问题不是很大。
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5楼2012-10-22 13:24:36
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