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huangyan0517金虫 (小有名气)
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[求助]
sds崩溃了，求解答
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我把步骤说的详细些： 溶液都是按分子克隆实验书上配的，30%丙烯酰胺混合液（29:1），1.5mol/，ph8.8的ltris，1mol/l ph6.8tris ，用1mol/l ph6.8tris配的上样buffer，5倍电泳缓冲液（15.1g tris，94g gly，5g sds，1000ml）。 配胶的过程： 用的伯乐mini 1mm电泳版，板洗干净之后夹好，晾干，用的时候直接用 分离胶15%，灌完分离胶，用蒸馏水封闭一下，大概1cm的高度 等大概20-30分钟，倒掉水，滤纸吸干，灌浓缩胶，插梳子，再过半小时拔梳子。 样品浓度比较高，大概17mg/ml，0.01M的PB溶液，之前是用20ul一倍上样buffer混合5ul样品，煮沸1min后上样，上样每孔20ul。 电泳条件为浓缩胶20min，分离胶50分钟。样品为溶菌酶及其多聚体混合物。 图如下，左边两条为自己做的marker，第一个为bsa，第二个为bsa和溶菌酶单体混合物。 目前问题如下： （1）拔完梳子之后，胶孔会有一层薄膜，应该是梳子和板之间不紧密，有空隙产生的，但是梳子是配套的，每次都会有样品加不进去的情况，用针挑也跳不干净，各位有没有这种情况，怎么解决的？ （2）ph8.8和6.8的ph用浓盐酸调好之后，ph还会变化，会增加0.1-0.2的ph，即使调好之后，还是没有压缩效应。 （3）胶配好之后，把板夹到电泳槽上，灌满电泳缓冲液，几乎每次第一次都会漏液，第二次就不会，操作完全一样 (4)电泳缓冲液没调过ph，上次测了一下，1倍大概8.5， （5）样品分子质量越大，拖尾月严重。 （6）0.01m pb离子强度影响很大吗 跪求高人解答 后面两个是跑的血清样品，浓缩胶5%，分离胶10%，其他条件基本和上面一直，手机拍的，不太清楚，拜托也给分析分析。  溶菌酶浓缩液.jpg  1.JPG  2.JPG |
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【答案】应助回帖
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Tris缓冲液的pH非常重要，否则条带不sharp。调pH时加浓盐酸接近所需pH，令其冷却至室温后再慢慢用1N盐酸调。电泳液不必调pH，本身就是用的Tris-glycine缓冲体系。 胶在20分钟内凝可能有些快，一般是30-60分钟凝为宜。凝胶速度过快会造成孔径不均一。 为了减少电泳液漏的问题，可以在安装电泳装置时用1×的电泳液润湿玻璃短板和所夹电极板。 如果你觉得样品浓缩不好，可以适当加长浓缩胶，小胶大约1cm应该可以了。 感觉上样量有点大。不是说不行，但想要很sharp的条带，最好上样量减半。顺便问一下，你上样前是否对样品做了离心？ 磷酸缓冲液对跑SDS胶有点影响，但10mM问题不是很大。 |
5楼2012-10-22 13:24:36
huangyan0517
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