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wei_suzhen

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增后,除了marker什么都没有,是什么原因呀?

这是我引物的一些信息:上游引物的GC%含量是54.5%,Tm值是64.5°C,;下游引物GC%含量是66.7%,Tm值67.4°C。今天PCR通过设计退火温度梯度53.3℃、53.9℃、55.3℃、56.4℃、57.6℃、58.0℃,94℃预变性5min,94℃变性30s,72℃延伸2min,退货时间45s,30个循环。目的基因长度1257bp,配的0.8%的胶,190V电压(实验室都用这个电压),电泳后检测,除了maker什么都没有.不知道什么哪出问题啦?求大师指点。

[ Last edited by wei_suzhen on 2012-10-19 at 16:01 ]
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狐狸尾巴

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
首先要回过头去确定自己设计的引物有没有问题
然后检查pcr混合物中是不是少放了某一种东西
从什么里面p,文库还是载体?如果是载体的话直接退火温度设成58度,30个循环就搞定了,哪里需要用什么梯度:
2楼2012-10-19 16:25:19
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wei_suzhen

新虫 (小有名气)

从黑曲霉基因组里p
3楼2012-10-19 17:45:37
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tulip1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
从酶、引物、退火温度、模板浓度四个方面分析啊。模板浓度也很重要的,退火最高可试60—62度
4楼2012-10-19 22:28:16
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wei_suzhen

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-10-19 22:28:16
从酶、引物、退火温度、模板浓度四个方面分析啊。模板浓度也很重要的,退火最高可试60—62度

谢谢
5楼2012-10-19 22:37:24
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