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weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] 关于XhoI和SacI双酶切的问题

看过一个回帖说两个酶切位点如果共用碱基就连不上表达载体，我选的 SacI（GAGCT C）和 Xhol（C TCGAG）酶切位点，这两个是不是共用碱基啊，那双酶切后连表达载体是不是就连不上上啊，求高手指导，可是分析我的序列只有这两个酶切位点可用，怎么办啊，还有如果连上的话，那么在目的序列会不会在载体上连反了

[ Last edited by weining1203 on 2012-10-14 at 22:53 ]
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1楼 2012-10-14 22:48:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-15 13:46:44
两个酶切位点共用碱基不是连不上，而是可能切不开。要查看两个酶切位点是否共用碱基，你需要查看所用载体的多克隆位点的序列。有的时候共用碱基同步切不行可以分步切，你需要查看共用碱基的位置和酶切的位点来判断。但是最好不要选共用碱基的双酶切位点来克隆。
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2楼2012-10-15 01:18:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

忘了说你提到的那两个酶切位点不是共用碱基。识别序列都是从5‘到3’写的，你那两个明显是不同的序列。只要不是同尾酶就不会发生连反的问题。
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weining1203
3楼2012-10-15 06:49:31
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weining1203

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-15 06:49:31
忘了说你提到的那两个酶切位点不是共用碱基。识别序列都是从5‘到3’写的，你那两个明显是不同的序列。只要不是同尾酶就不会发生连反的问题。

谢谢您的回复，弱弱的问一句，什么事同尾酶？ 我自己在下面看了一下，酶切开的两端末端极有可能连反
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4楼2012-10-15 08:51:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by weining1203 at 2012-10-15 08:51:03
谢谢您的回复，弱弱的问一句，什么事同尾酶？ 我自己在下面看了一下，酶切开的两端末端极有可能连反...

同尾酶是两种不同的限制性内切酶，但切出的粘性末端相同，故而可以相连。你的那两个酶不是的。SacI切出的是3’突出的AGCT, Xho切出的是5’突出的TCGA。无论是序列还是突出的方向都完全不一样，根本不可能连反。
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5楼2012-10-15 09:17:47
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-15 06:49:31
忘了说你提到的那两个酶切位点不是共用碱基。识别序列都是从5‘到3’写的，你那两个明显是不同的序列。只要不是同尾酶就不会发生连反的问题。

双酶切后，目的序列：5      C      ATG...........TGA     C            3
                      TCGAG                                  GAGCT

载体上的末端        GAGCT                                       TCGAG
                                C                                                       C
那么目的序列无论从5端到3端 还是3端到5端都能和载体连接，不知道我这样分析对不对？
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6楼2012-10-15 09:28:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
weining1203: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-10-15 10:15:33
内容已删除
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7楼2012-10-15 09:37:25
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-15 09:37:25
你分析的是对的，但是这也不能反连。反过来不仅是突出末端不对，而且序列也是互补的。你可以用一个什么软件分析所有的连接产物。这也是为什么要用两个不同的限制性内切酶做克隆的原因，可以不必筛正反了。...

看了您的回复，心里的石头终于落下了，不能反连就行。就是因为正向和反向连都互补，我才以为会有连反的概率。以后有问题再请教您，谢谢
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8楼2012-10-15 10:15:21
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kalsy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by weining1203 at 2012-10-15 10:15:21
看了您的回复，心里的石头终于落下了，不能反连就行。就是因为正向和反向连都互补，我才以为会有连反的概率。以后有问题再请教您，谢谢...

你好!我最近也要做这两个酶的双酶切。你做的效果怎么样啊？是分布切的还是一起切的，可以详细说说嘛？初学者，请多多帮助。。谢谢
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9楼2013-09-13 16:19:19
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