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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 感受态转化
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380218013

金虫 (小有名气)

[交流] 感受态转化

最近小弟做感受态转化实验。结果发现空的感受态在AMP平板也长菌落。AMP平板式100毫升+100微升AMP（100毫克每毫升），这样终浓度是100微克每毫升。有木有人有同样的经历和解决办法啊 ？？？
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1楼 2012-10-13 09:09:16
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
380218013(金币+1): 谢谢参与
氨苄只是抑菌，并且一般认为超过18h氨苄失效，所以如果空的感受态细胞培养时间太长并且密度很大的情况下也可能会长
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8楼2012-10-13 16:56:55
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frcheng

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
建议热激42s试试
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20楼2012-10-14 08:50:45
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马儿快跑

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
42度热激45秒就够了  我们是这样做的  效果很好的，像你种情况楼上各位已经分析的很透彻了，一是感受态被污染或突变了，一个是抗生素失效了！你可以再重复一次！
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27楼2012-10-16 15:23:39
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普通回帖

seraph09

新虫 (初入文坛)
★
380218013(金币+1): 谢谢参与
你得感受态是买的还是自己做的？能不能详细说明你得转化步骤？
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2楼2012-10-13 09:17:17
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j2

木虫 (正式写手)
★
380218013(金币+1): 谢谢参与
AMP是否有效？感受态是自制还是购买？
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3楼2012-10-13 09:30:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-13 16:28:05
如果是购买的感受态细胞，应该不能在氨苄板上长，有可能是抗生素部分失效，或者是到平板是培养基太热。氨苄对温度比较敏感，到板时要让培养基温度冷却到50度以下再加抗生素。
如果自制的感受态，有可能是做感受态过程中有污染。
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4楼2012-10-13 09:45:36
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wolvesdancer

铁杆木虫 (正式写手)
★
380218013(金币+1): 谢谢参与
空载的菌本来就能长，可以做蓝白斑筛选确定阳性转化子
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5楼2012-10-13 10:23:23
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daisy143

至尊木虫 (职业作家)
★
380218013(金币+1): 谢谢参与
帮顶
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7楼2012-10-13 12:30:32
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gwd0312

木虫 (正式写手)
★
380218013(金币+1): 谢谢参与
建议做个蓝白斑筛选！
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9楼2012-10-13 17:15:23
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380218013

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by seraph09 at 2012-10-13 09:17:17
你得感受态是买的还是自己做的？能不能详细说明你得转化步骤？

买的感受态。步骤质粒50ng加50ul感受态 冰上30min 42°热激 90s 冰上三分钟。加200ul 无AMP培养基扩增30min，涂布平板。过夜。
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10楼2012-10-13 19:57:35
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380218013

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by j2 at 2012-10-13 09:30:57
AMP是否有效？感受态是自制还是购买？

我第一次也以为是AMP失效  新配的 还是长的 。感受态是买的
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11楼2012-10-13 19:58:15
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380218013

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-13 09:45:36
如果是购买的感受态细胞，应该不能在氨苄板上长，有可能是抗生素部分失效，或者是到平板是培养基太热。氨苄对温度比较敏感，到板时要让培养基温度冷却到50度以下再加抗生素。
如果自制的感受态，有可能是做感受态过 ...

AMP 是先配的  加的温度注意了，手可以握着瓶子的时候加的AMP 应该不是温度的原因。
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12楼2012-10-13 19:59:29
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380218013

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wolvesdancer at 2012-10-13 10:23:23
空载的菌本来就能长，可以做蓝白斑筛选确定阳性转化子

其实我也想知道空载的菌是不是可以长的。。你这么肯定的话 我心理就有数了
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13楼2012-10-13 20:00:23
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380218013

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by joan198108 at 2012-10-13 16:56:55
氨苄只是抑菌，并且一般认为超过18h氨苄失效，所以如果空的感受态细胞培养时间太长并且密度很大的情况下也可能会长

就是说空载的感受态本身是可以再AMP上长的是吗？？我是涂布之后过夜的  肯定过18h了
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14楼2012-10-13 20:01:28
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380218013

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-10-13 17:15:23
建议做个蓝白斑筛选！

能否给个步骤啊 大虾。没有做过呢
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15楼2012-10-13 20:02:20
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wolvesdancer

铁杆木虫 (正式写手)
★
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13楼: Originally posted by 380218013 at 2012-10-13 20:00:23
其实我也想知道空载的菌是不是可以长的。。你这么肯定的话 我心理就有数了...

你的问题没说太详细，具体用的什么载体？
如果Amp抗性是载体上的，那空载的菌长出来很正常啊，不长才不正常
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18楼2012-10-13 23:35:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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14楼: Originally posted by 380218013 at 2012-10-13 20:01:28
就是说空载的感受态本身是可以再AMP上长的是吗？？我是涂布之后过夜的  肯定过18h了...

你的空对照是加了空载体，还是直接用感受态细胞做的呀？什么都不加或者加水做的空对照不能在氨苄板上长。如果是查看载体自连的情况用没加插入片段的空载体做的对照是可以在抗性板上长的。至于时间过长而导致氨苄失效的问题要看你空板上的菌落大小，是否和转化了连接产物的一样呢？
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19楼2012-10-14 01:17:19
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380218013

金虫 (小有名气)
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19楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-14 01:17:19
你的空对照是加了空载体，还是直接用感受态细胞做的呀？什么都不加或者加水做的空对照不能在氨苄板上长。如果是查看载体自连的情况用没加插入片段的空载体做的对照是可以在抗性板上长的。至于时间过长而导致氨苄失 ...

直接感受态涂布的   菌落大小稍微比转质粒的大一点。
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21楼2012-10-14 09:52:05
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380218013

金虫 (小有名气)
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18楼: Originally posted by wolvesdancer at 2012-10-13 23:35:39
你的问题没说太详细，具体用的什么载体？
如果Amp抗性是载体上的，那空载的菌长出来很正常啊，不长才不正常...

PGL sv40载体 是AMP抗性的 现在问题是我只用感受态，不转化，涂布AMP也长了很多菌落
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22楼2012-10-14 09:55:12
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380218013

金虫 (小有名气)
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20楼: Originally posted by frcheng at 2012-10-14 08:50:45
建议热激42s试试

大哥 可以吗
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23楼2012-10-14 09:55:27
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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21楼: Originally posted by 380218013 at 2012-10-14 09:52:05
直接感受态涂布的   菌落大小稍微比转质粒的大一点。...

如果氨苄的板没问题的话，检查复苏是所加LB是否污染。还有可以你挑几个菌落在液体LB+AMP培养过夜看看是不是正常。
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24楼2012-10-14 14:58:52
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damaomao

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
25楼2012-10-15 13:26:37
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hzlatqh

银虫 (小有名气)
就是amp平板失效了。。。
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26楼2012-10-16 00:05:18
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寂寞又美好

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
极有可能是AMP失效了，因为这个我就出现过这种情况百思不得其解，最后终于找到了原因，建议重新买一瓶配好的AMP，如果买到的是固体粉末一定要用细菌滤器过滤，要严格按照无菌操作
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28楼2012-10-16 16:14:21
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flyxu6楼
2012-10-13 10:46   回复  
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chenzhana16楼
2012-10-13 20:30   回复  
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chenruia17楼
2012-10-13 20:41   回复  
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