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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » cDNA文库构建lambda dilution buffer的配制
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含羞草liu

新虫 (小有名气)

[求助] cDNA文库构建lambda dilution buffer的配制

大家好！我最近要建一个cDNA文库，选用的是Clontech的SMART cDNA Library Construction Kit，要求自己配制10×lambda dilution buffer和1×lambda dilution buffer。我要配制1M Tris-HCl （pH 7.5），实验室现在有Tris hydrochloride固体，瓶子上标有pH(0.1M)为3.5-5.0，这要怎么配制啊？此外，还有2% Gelatin，这里的2%是还是质量体积比吗？具体要怎么配制呢？请各位帮个忙，谢谢！

附：已知配方为：
10× Lambda dilution buffer
                                终浓度             配制1L溶液需要量
NaCl                          1.0 M                              58.3 g
MgSO4•7H2O             0.1 M                             24.65 g
Tris-HCl （pH 7.5）  0.35 M                        350.0 ml of 1 M
加H2O到终体积为1L。高压灭菌，4℃保存。
1× Lambda dilution buffer
100 ml    10× Lambda dilution buffer
5 ml        2% Gelatin（0.01%终浓度）
加H2O到终体积为1L。高压灭菌，4℃保存。
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努力，奋斗，拼搏。。。
1楼2012-09-30 16:04:49
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bohr86

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 含羞草liu at 2012-10-06 10:02:55
问下，明胶在配制后，要灭菌吗？如果要灭菌，是高压灭菌还是直接0.22um滤头过滤呢？...

Gelatin直接用无菌水配置，适当加热溶解就行了；Gelatin也可以高温高压灭菌（121℃，15～30min），但灭菌进行一次就够了，反复加热gelatin的话，其结构容易破坏，造成胶无法凝固！
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5楼2012-10-06 22:32:49
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bohr86

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+4, 鼓励应助 2012-10-07 17:24:07
第一个问题：我觉得你还是不要用Tris hydrochloride 来配置Tris 缓冲溶液，里面的HCl比较多，配出来会偏酸性，调碱一般有两种方法：添加Tris base ，但会增加缓冲溶液的浓度；用NaOH调又会带入新的离子，可能会对下面实验有影响。为什么不直接用Tris base 配呢？
第二个问题：2%的Gelatin一般只的是w/v浓度.
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含羞草liu
2楼2012-10-05 23:03:26
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
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2楼: Originally posted by bohr86 at 2012-10-05 23:03:26
第一个问题：我觉得你还是不要用Tris hydrochloride 来配置Tris 缓冲溶液，里面的HCl比较多，配出来会偏酸性，调碱一般有两种方法：添加Tris base ，但会增加缓冲溶液的浓度；用NaOH调又会带入新的离子，可能会对下 ...

呵呵，谢谢啊！很有帮助！
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努力，奋斗，拼搏。。。
3楼2012-10-06 09:25:25
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bohr86 at 2012-10-05 23:03:26
第一个问题：我觉得你还是不要用Tris hydrochloride 来配置Tris 缓冲溶液，里面的HCl比较多，配出来会偏酸性，调碱一般有两种方法：添加Tris base ，但会增加缓冲溶液的浓度；用NaOH调又会带入新的离子，可能会对下 ...

问下，明胶在配制后，要灭菌吗？如果要灭菌，是高压灭菌还是直接0.22um滤头过滤呢？
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努力，奋斗，拼搏。。。
4楼2012-10-06 10:02:55
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by bohr86 at 2012-10-06 22:32:49
Gelatin直接用无菌水配置，适当加热溶解就行了；Gelatin也可以高温高压灭菌（121℃，15～30min），但灭菌进行一次就够了，反复加热gelatin的话，其结构容易破坏，造成胶无法凝固！...

好的，我直接用ddH2O配制了，打算再高压灭菌，谢谢你哦！
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努力，奋斗，拼搏。。。
6楼2012-10-07 10:07:28
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bohr86

木虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by 含羞草liu at 2012-10-07 10:07:28
好的，我直接用ddH2O配制了，打算再高压灭菌，谢谢你哦！...

不用客气～
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7楼2012-10-07 15:08:08
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by bohr86 at 2012-10-07 15:08:08
不用客气～...

你好！我将2%的Gelatin进行高压灭菌，121℃，30min。但是灭菌后，溶液不再黏稠，就像水一样的，这是正常的吗？还是高压灭菌已经破坏了它的结构？
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努力，奋斗，拼搏。。。
8楼2012-10-09 15:12:57
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bohr86

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 含羞草liu at 2012-10-09 15:12:57
你好！我将2%的Gelatin进行高压灭菌，121℃，30min。但是灭菌后，溶液不再黏稠，就像水一样的，这是正常的吗？还是高压灭菌已经破坏了它的结构？...

灭菌后，冷却都不能形成凝胶了？ 这个gelatin 什么牌子的？
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9楼2012-10-10 11:56:13
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by bohr86 at 2012-10-10 11:56:13
灭菌后，冷却都不能形成凝胶了？ 这个gelatin 什么牌子的？...

是的，冷却后一点不凝。我是在生工买的，品牌是BBI，100g 粉末状的。
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努力，奋斗，拼搏。。。
10楼2012-10-10 15:14:56
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