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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB问题
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zds2257

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] WB问题

跪求各位大神，我刚开始做WB，我的分子量是80KD是植物核蛋白，提的植物的总蛋白，5% +10%电泳5小时，maker还没完全跑出浓缩胶，就一起进行80V恒压湿法转PVDF0.22膜转6个小时，转完后染胶无条带，转完后是用的试剂盒，封闭，稀释抗体，洗膜都是用试剂盒里的blocking buffer（5%脱脂奶粉PBST稀释），封闭一个小时，洗都洗5次只是每次加的量不多，压膜曝光2小时，结果背景很深看不到目的带，maker只看到一条带,求分析原因
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1楼 2012-09-12 16:57:21
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回帖置顶 ( 共有1个 )

david0308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare: 金币+2, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2012-09-17 17:29:08
首先，pvdf膜的孔径不对，如果是大分子的话可能不能很好的转到膜上。其次，你的压膜时间太长了，一般来讲十分钟压不出来基本上再长时间也出不来了。而且时间太长背景很高是很正常的，这个一定要缩短压膜时间，block时间其实没大影响的，你可以试试横流400mA转2.5h，那样的可能效率更高。另外TBST和running buffer比较脏也不好。
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哈哈
5楼2012-09-17 13:59:12
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普通回帖

xiaoqi5992

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2012-09-15 03:19:04
我分析可能的原因：1.blocking buffer 的封闭时间是不是有点短，增加到两小时试试；2.压膜的时间可以摸索下， 看荧光的强度，适当缩短点。
还有，80kd 的蛋白是不是用0.45的膜好点啊。
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zds2257
2楼2012-09-14 16:59:50
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zds2257

铁杆木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaoqi5992 at 2012-09-14 16:59:50
我分析可能的原因：1.blocking buffer 的封闭时间是不是有点短，增加到两小时试试；2.压膜的时间可以摸索下， 看荧光的强度，适当缩短点。
还有，80kd 的蛋白是不是用0.45的膜好点啊。

嗯 封闭已变成2小时压膜变成一小时 情况是其他地方背景好了点 但泳道里背景还是不好  好像有许多非特异性又不清晰的带
实验室没有0.45孔径的  这个影响很大吗？
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3楼2012-09-14 23:52:45
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xiaoqi5992

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zds2257 at 2012-09-14 23:52:45
嗯 封闭已变成2小时压膜变成一小时 情况是其他地方背景好了点 但泳道里背景还是不好  好像有许多非特异性又不清晰的带
实验室没有0.45孔径的  这个影响很大吗？...

0.22μm用于小分子量蛋白小于20KD和0.45μm用于大分子量蛋白。
之前我做45kd的用过22um的，感觉蛋白不能很好的转到膜上。
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4楼2012-09-17 08:43:21
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zds2257

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiaoqi5992 at 2012-09-17 08:43:21
0.22μm用于小分子量蛋白小于20KD和0.45μm用于大分子量蛋白。
之前我做45kd的用过22um的，感觉蛋白不能很好的转到膜上。...

哦 只是实验室有一堆的0.22的膜 没有0.45的
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6楼2012-09-18 12:42:51
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gaorongbest

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wizardfan: 金币+1, 谢谢分享经验 2012-09-19 05:39:19
我们转膜的时候都是200mA转膜2.5小时或80mA转过夜，对应的电压是不是80V就不清楚了（我只是说说我们的，仅供你参考，排查原因），转膜结束后先用苏丹红染色看是否转到膜上了（一般Marker用预染的，这样转膜后可以看到胶上没有Marker残留说明转到了膜上，不包括转过了，苏丹红染色有条带说明没转过），之后再封闭，2小时，按抗体要求加一抗二抗；你采用什么方式曝光的？一般都是30min内都可以看到了，时间长了背景也染色了，图片不漂亮。
    你的Marker只看到一条，是哪一条？是较大的一条吗？如果是这样，就可能是转膜过了。
    希望对你有帮助
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zds2257
为客户提供更好的科研外包服务：如分子、免疫、病理、细胞培养、动物实验等
7楼2012-09-18 21:10:54
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zds2257

铁杆木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by gaorongbest at 2012-09-18 21:10:54
我们转膜的时候都是200mA转膜2.5小时或80mA转过夜，对应的电压是不是80V就不清楚了（我只是说说我们的，仅供你参考，排查原因），转膜结束后先用苏丹红染色看是否转到膜上了（一般Marker用预染的，这样转膜后可以看 ...

哦  我们这80V差不多200mA多一点 转后发现预染的maker胶上完全没有残留  染色也有条带 只是蛋白条带提完后预跑染色发现条带不亮  而且我目的蛋白来源于核中   用的手动的压膜后显影定影
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8楼2012-09-18 22:01:59
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