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WB问题
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| 跪求各位大神，我刚开始做WB，我的分子量是80KD是植物核蛋白，提的植物的总蛋白，5% +10%电泳5小时，maker还没完全跑出浓缩胶，就一起进行80V恒压湿法转PVDF0.22膜转6个小时，转完后染胶无条带，转完后是用的试剂盒，封闭，稀释抗体，洗膜都是用试剂盒里的blocking buffer（5%脱脂奶粉PBST稀释），封闭一个小时，洗都洗5次只是每次加的量不多，压膜曝光2小时，结果背景很深看不到目的带，maker只看到一条带,求分析原因 |
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【答案】应助回帖
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wizardfan: 金币+1, 谢谢分享经验 2012-09-19 05:39:19
wizardfan: 金币+1, 谢谢分享经验 2012-09-19 05:39:19
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我们转膜的时候都是200mA转膜2.5小时或80mA转过夜，对应的电压是不是80V就不清楚了（我只是说说我们的，仅供你参考，排查原因），转膜结束后先用苏丹红染色看是否转到膜上了（一般Marker用预染的，这样转膜后可以看到胶上没有Marker残留说明转到了膜上，不包括转过了，苏丹红染色有条带说明没转过），之后再封闭，2小时，按抗体要求加一抗二抗；你采用什么方式曝光的？一般都是30min内都可以看到了，时间长了背景也染色了，图片不漂亮。 你的Marker只看到一条，是哪一条？是较大的一条吗？如果是这样，就可能是转膜过了。 希望对你有帮助  |
zds2257
7楼2012-09-18 21:10:54
xiaoqi5992
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xiaoqi5992
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