应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB问题
51/1返回列表
查看: 1914  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zds2257

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] WB问题

跪求各位大神，我刚开始做WB，我的分子量是80KD是植物核蛋白，提的植物的总蛋白，5% +10%电泳5小时，maker还没完全跑出浓缩胶，就一起进行80V恒压湿法转PVDF0.22膜转6个小时，转完后染胶无条带，转完后是用的试剂盒，封闭，稀释抗体，洗膜都是用试剂盒里的blocking buffer（5%脱脂奶粉PBST稀释），封闭一个小时，洗都洗5次只是每次加的量不多，压膜曝光2小时，结果背景很深看不到目的带，maker只看到一条带,求分析原因
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2012-09-12 16:57:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zds2257

铁杆木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaoqi5992 at 2012-09-14 16:59:50
我分析可能的原因：1.blocking buffer 的封闭时间是不是有点短，增加到两小时试试；2.压膜的时间可以摸索下， 看荧光的强度，适当缩短点。
还有，80kd 的蛋白是不是用0.45的膜好点啊。

嗯 封闭已变成2小时压膜变成一小时 情况是其他地方背景好了点 但泳道里背景还是不好  好像有许多非特异性又不清晰的带
实验室没有0.45孔径的  这个影响很大吗？
赞一下 回复此楼
3楼2012-09-14 23:52:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

xiaoqi5992

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2012-09-15 03:19:04
我分析可能的原因：1.blocking buffer 的封闭时间是不是有点短，增加到两小时试试；2.压膜的时间可以摸索下， 看荧光的强度，适当缩短点。
还有，80kd 的蛋白是不是用0.45的膜好点啊。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

zds2257
2楼2012-09-14 16:59:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaoqi5992

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zds2257 at 2012-09-14 23:52:45
嗯 封闭已变成2小时压膜变成一小时 情况是其他地方背景好了点 但泳道里背景还是不好  好像有许多非特异性又不清晰的带
实验室没有0.45孔径的  这个影响很大吗？...

0.22μm用于小分子量蛋白小于20KD和0.45μm用于大分子量蛋白。
之前我做45kd的用过22um的，感觉蛋白不能很好的转到膜上。
赞一下 回复此楼
4楼2012-09-17 08:43:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

david0308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare: 金币+2, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2012-09-17 17:29:08
首先，pvdf膜的孔径不对，如果是大分子的话可能不能很好的转到膜上。其次，你的压膜时间太长了，一般来讲十分钟压不出来基本上再长时间也出不来了。而且时间太长背景很高是很正常的，这个一定要缩短压膜时间，block时间其实没大影响的，你可以试试横流400mA转2.5h，那样的可能效率更高。另外TBST和running buffer比较脏也不好。
赞一下 回复此楼
哈哈
5楼2012-09-17 13:59:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 复试调剂 +4 z1z2z3879 2026-03-14 6/300 2026-03-19 17:18 by fei626-918
[考研] 【考研调剂】化学专业 281分，一志愿四川大学，诚心求调剂 +5 吃吃吃才有意义 2026-03-19 5/250 2026-03-19 16:18 by 30660438
[考研] 一志愿 西北大学 ，070300化学学硕，总分287，双非一本，求调剂。 +3 晨昏线与星海 2026-03-19 3/150 2026-03-19 13:36 by houyaoxu
[考研] 085600材料与化工求调剂 +6 绪幸与子 2026-03-17 6/300 2026-03-19 13:27 by houyaoxu
[考研] 281求调剂（0805） +9 烟汐忆海 2026-03-16 19/950 2026-03-19 11:42 by laoshidan
[考研] 346求调剂[0856] +3 WayneLim327 2026-03-16 6/300 2026-03-19 11:21 by WayneLim327
[考研] 一志愿华中科技大学，080502，354分求调剂 +4 守候夕阳CF 2026-03-18 4/200 2026-03-18 22:16 by li123456789.
[考研] 344求调剂 +6 knight344 2026-03-16 7/350 2026-03-18 20:13 by walc
[考研] 070300化学319求调剂 +6 锦鲤0909 2026-03-17 6/300 2026-03-18 13:22 by Iveryant
[考研] 299求调剂 +5 △小透明* 2026-03-17 5/250 2026-03-18 11:49 by 尽舜尧1
[考研] 280求调剂 +6 咕噜晓晓 2026-03-18 7/350 2026-03-18 11:25 by 无际的草原
[考研] 268求调剂 +8 一定有学上- 2026-03-14 9/450 2026-03-17 17:47 by laoshidan
[硕博家园] 湖北工业大学 生命科学与健康学院-课题组招收2026级食品/生物方向硕士 +3 1喜春8 2026-03-17 5/250 2026-03-17 17:18 by ber川cool子
[考研] 考研化学学硕调剂，一志愿985 +4 张vvvv 2026-03-15 6/300 2026-03-17 17:15 by ruiyingmiao
[考研] 26考研求调剂 +6 丶宏Sir 2026-03-13 6/300 2026-03-17 16:13 by 醉在风里
[考研] 有没有道铁/土木的想调剂南林，给自己招师弟中～ +3 TqlXswl 2026-03-16 7/350 2026-03-17 15:23 by TqlXswl
[考研] 一志愿南京大学，080500材料科学与工程，调剂 +4 Jy? 2026-03-16 4/200 2026-03-17 11:02 by gaoqiong
[考研] 085600材料与化工 求调剂 +13 enenenhui 2026-03-13 14/700 2026-03-16 15:19 by 了了了了。。
[考研] 326求调剂 +3 mlpqaz03 2026-03-15 3/150 2026-03-16 07:33 by Iveryant
[考研] 085601材料工程315分求调剂 +3 yang_0104 2026-03-15 3/150 2026-03-15 10:58 by peike
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭