应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB问题
51/1返回列表
查看: 1864  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zds2257

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] WB问题

跪求各位大神，我刚开始做WB，我的分子量是80KD是植物核蛋白，提的植物的总蛋白，5% +10%电泳5小时，maker还没完全跑出浓缩胶，就一起进行80V恒压湿法转PVDF0.22膜转6个小时，转完后染胶无条带，转完后是用的试剂盒，封闭，稀释抗体，洗膜都是用试剂盒里的blocking buffer（5%脱脂奶粉PBST稀释），封闭一个小时，洗都洗5次只是每次加的量不多，压膜曝光2小时，结果背景很深看不到目的带，maker只看到一条带,求分析原因
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2012-09-12 16:57:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zds2257

铁杆木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaoqi5992 at 2012-09-14 16:59:50
我分析可能的原因：1.blocking buffer 的封闭时间是不是有点短，增加到两小时试试；2.压膜的时间可以摸索下， 看荧光的强度，适当缩短点。
还有，80kd 的蛋白是不是用0.45的膜好点啊。

嗯 封闭已变成2小时压膜变成一小时 情况是其他地方背景好了点 但泳道里背景还是不好  好像有许多非特异性又不清晰的带
实验室没有0.45孔径的  这个影响很大吗？
赞一下 回复此楼
3楼2012-09-14 23:52:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

xiaoqi5992

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2012-09-15 03:19:04
我分析可能的原因：1.blocking buffer 的封闭时间是不是有点短，增加到两小时试试；2.压膜的时间可以摸索下， 看荧光的强度，适当缩短点。
还有，80kd 的蛋白是不是用0.45的膜好点啊。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

zds2257
2楼2012-09-14 16:59:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaoqi5992

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zds2257 at 2012-09-14 23:52:45
嗯 封闭已变成2小时压膜变成一小时 情况是其他地方背景好了点 但泳道里背景还是不好  好像有许多非特异性又不清晰的带
实验室没有0.45孔径的  这个影响很大吗？...

0.22μm用于小分子量蛋白小于20KD和0.45μm用于大分子量蛋白。
之前我做45kd的用过22um的，感觉蛋白不能很好的转到膜上。
赞一下 回复此楼
4楼2012-09-17 08:43:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

david0308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare: 金币+2, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2012-09-17 17:29:08
首先，pvdf膜的孔径不对，如果是大分子的话可能不能很好的转到膜上。其次，你的压膜时间太长了，一般来讲十分钟压不出来基本上再长时间也出不来了。而且时间太长背景很高是很正常的，这个一定要缩短压膜时间，block时间其实没大影响的，你可以试试横流400mA转2.5h，那样的可能效率更高。另外TBST和running buffer比较脏也不好。
赞一下 回复此楼
哈哈
5楼2012-09-17 13:59:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭