应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB问题
51/1返回列表
查看: 1915  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zds2257

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] WB问题

跪求各位大神，我刚开始做WB，我的分子量是80KD是植物核蛋白，提的植物的总蛋白，5% +10%电泳5小时，maker还没完全跑出浓缩胶，就一起进行80V恒压湿法转PVDF0.22膜转6个小时，转完后染胶无条带，转完后是用的试剂盒，封闭，稀释抗体，洗膜都是用试剂盒里的blocking buffer（5%脱脂奶粉PBST稀释），封闭一个小时，洗都洗5次只是每次加的量不多，压膜曝光2小时，结果背景很深看不到目的带，maker只看到一条带,求分析原因
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2012-09-12 16:57:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

david0308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare: 金币+2, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2012-09-17 17:29:08
首先，pvdf膜的孔径不对，如果是大分子的话可能不能很好的转到膜上。其次，你的压膜时间太长了，一般来讲十分钟压不出来基本上再长时间也出不来了。而且时间太长背景很高是很正常的，这个一定要缩短压膜时间，block时间其实没大影响的，你可以试试横流400mA转2.5h，那样的可能效率更高。另外TBST和running buffer比较脏也不好。
赞一下 回复此楼
哈哈
5楼2012-09-17 13:59:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

xiaoqi5992

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2012-09-15 03:19:04
我分析可能的原因：1.blocking buffer 的封闭时间是不是有点短，增加到两小时试试；2.压膜的时间可以摸索下， 看荧光的强度，适当缩短点。
还有，80kd 的蛋白是不是用0.45的膜好点啊。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

zds2257
2楼2012-09-14 16:59:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zds2257

铁杆木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaoqi5992 at 2012-09-14 16:59:50
我分析可能的原因：1.blocking buffer 的封闭时间是不是有点短，增加到两小时试试；2.压膜的时间可以摸索下， 看荧光的强度，适当缩短点。
还有，80kd 的蛋白是不是用0.45的膜好点啊。

嗯 封闭已变成2小时压膜变成一小时 情况是其他地方背景好了点 但泳道里背景还是不好  好像有许多非特异性又不清晰的带
实验室没有0.45孔径的  这个影响很大吗？
赞一下 回复此楼
3楼2012-09-14 23:52:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaoqi5992

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zds2257 at 2012-09-14 23:52:45
嗯 封闭已变成2小时压膜变成一小时 情况是其他地方背景好了点 但泳道里背景还是不好  好像有许多非特异性又不清晰的带
实验室没有0.45孔径的  这个影响很大吗？...

0.22μm用于小分子量蛋白小于20KD和0.45μm用于大分子量蛋白。
之前我做45kd的用过22um的，感觉蛋白不能很好的转到膜上。
赞一下 回复此楼
4楼2012-09-17 08:43:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 271材料工程求调剂 +6 .6lL 2026-03-18 6/300 2026-03-19 15:41 by haoshis
[考研] 一志愿西安交通大学材料工程专业 282分求调剂 +5 枫桥ZL 2026-03-18 7/350 2026-03-19 14:52 by 功夫疯狂
[考研] 一志愿 西北大学 ，070300化学学硕，总分287，双非一本，求调剂。 +3 晨昏线与星海 2026-03-19 3/150 2026-03-19 13:36 by houyaoxu
[考研] 一志愿福大288有机化学，求调剂 +3 小木虫200408204 2026-03-18 3/150 2026-03-19 13:31 by houyaoxu
[考研] 一志愿中海洋材料工程专硕330分求调剂 +7 小材化本科 2026-03-18 7/350 2026-03-19 10:46 by Linda Hu
[考研] 一志愿天大材料与化工（085600）总分338 +5 蔡大美女 2026-03-13 5/250 2026-03-19 10:44 by 是小刘呀～
[考研] 332求调剂 +3 ydfyh 2026-03-17 3/150 2026-03-19 10:14 by 功夫疯狂
[考研] 085700资源与环境308求调剂 +3 墨墨漠 2026-03-18 3/150 2026-03-18 22:35 by bingxueer79
[考研] 26调剂/材料/英一数二/总分289/已过A区线 +7 步川酷紫123 2026-03-13 7/350 2026-03-18 17:12 by 尽舜尧1
[考研] 085600材料与化工 +5 安全上岸！ 2026-03-16 5/250 2026-03-18 15:33 by cmz0325
[考研] 08工科 320总分 求调剂 +5 梨花珞晚风 2026-03-17 5/250 2026-03-18 14:49 by haxia
[考研] 311求调剂 +11 冬十三 2026-03-15 12/600 2026-03-18 14:36 by 星空星月
[考研] 268求调剂 +7 好运连绵不绝 2026-03-12 8/400 2026-03-17 20:28 by xilongliang
[考研] 085601求调剂 +4 Du.11 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:08 by ruiyingmiao
[考研] 290求调剂 +3 p asserby. 2026-03-15 4/200 2026-03-17 16:35 by wangkm
[考研] 275求调剂 +4 太阳花天天开心 2026-03-16 4/200 2026-03-17 10:53 by 功夫疯狂
[考研] 考研调剂 +3 淇ya_~ 2026-03-17 5/250 2026-03-17 09:25 by Winj1e
[考研] 085600材料与化工 求调剂 +13 enenenhui 2026-03-13 14/700 2026-03-16 15:19 by 了了了了。。
[考研] 中科大材料与化工319求调剂 +3 孟鑫材料 2026-03-14 3/150 2026-03-14 20:10 by ms629
[考研] 295求调剂 +3 小匕仔汁 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:17 by vgtyfty
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭