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Allanflying

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[资源] EpiTect Bisulfite Kit,Qiagen 中文说明书

二．重亚硫酸处理试剂盒处理DNA(EpiTect Bisulfite Kit,Qiagen )
注意：
1）每管Bisulfite Mix能用于8个反应，若一次转化少于8个DNA样本，溶解的Bisulfite Mix保存于-20℃（4星期）。
2）DNA Protect Buffer在加入Bisulfite Mix后有绿色变为蓝色（第二步），表明转化反应充分且pH正确。
3）所有离心步骤均在室温下进行。

1.操作前：
1）缓冲液BW中加入30ml的（96%-100%）酒精，室温保存，在使用前上下颠倒试剂瓶数次混匀。
2）缓冲液BD中加入27ml的（96%-100%）酒精，2-8℃下保存，在使用前上下颠倒试剂瓶数次混匀。使用完后立即关上瓶盖。
3）往lyophilized carrier RNA (310μg)中加入310μl的RNase-free水，涡旋震荡使其溶解。分装溶解了的carrier RNA（如50ul/管）。carrier RNA能增强EpiTect 柱对DNA的吸附作用（特别是DNA量少时），如果DNA＞100ng时不需要carrier RNA。
4）往缓冲液BL中加carrier RNA，体积见表1。如果缓冲液BL中有沉淀，70℃溶解（轻轻晃动）。
5）将样品和Buffer拿到室温平衡。
6）孵育器60℃（步骤1），开启PCR仪。

Number of
samples 1 4 8 16 24 48
Buffer BL 620 μl 2.5 ml 5 ml 10 ml 15 ml 31 ml
carrier RNA
solution
6.2 μl
25 μl
50 μl
100 μl
150 μl
310 μl

2.操作步骤：
1） DNA样品解冻。取相应数量的Bisulfite Mix，每管Bisulfite Mix中加800ul的RNase-free水溶解。涡旋至Bisulfite Mix完全溶解（5min左右）。（注意：不要将Bisulfite Mix放到冰上；必要时可以放至60℃孵育再涡旋溶解）
2）在200ul的PCR管中准备重亚硫酸盐反应液。成分如表：

成分 Volume per reaction (μl)
DNA solution (1 ng-2 μg) Variable* (maximum 20 μl)
RNase-free水 Variable*
Bisulfite Mix (dissolved),步骤1 85
DNA Protect Buffer 35
总体积 140

3）盖上PCR管，完全混匀反应液。室温存放。（DNA Protect Buffer在加入Bisulfite Mix后有绿色变为蓝色，表明转化反应充分且pH正确）
4）放至PCR仪上反应。耗时约5小时。
程序如下：

5）开始运行PCR程序

3.纯化回收转化产物：
6）瞬离PCR管的转化液，转移至1.5ml的离心管中（若有沉淀，也将其转移）。
7）每管加入现配的560ul缓冲液BL（含carrier RNA），涡旋混匀后瞬离。
8）准备对应数量的EpiTect离心柱和收集管，将步骤7中的液体转移至离心柱中。
9）最大转速离心1分钟。弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中。
10）每个离心柱中加入500ul的缓冲液BW，最大转速离心1分钟。弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中。
11）每个离心柱中加入500ul的缓冲液BD，室温15分钟。（注意：若缓冲液BD中有沉淀，要避免将沉淀转移进去。加完缓冲液BD后要及时盖上盖子）
12）最大转速离心1分钟。弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中。
13）每个离心柱中加入500ul的缓冲液BW，最大转速离心1分钟。弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中。
14）重复步骤13一次.
15）将离心柱放至新的2ml收集管上，最大转速离心1分钟。
16）推荐步骤：将离心柱开盖，放在新的1.5ml离心管上（自备），56℃孵育5分钟。（注：蒸发残余液体）
17）将离心柱放至新的1.5ml离心管上（自备），加入20ul缓冲液EB（小心滴在中央膜上），15000g（12000rpm）1分钟。（注：再用20ul缓冲液EB重复步骤17以提高DNA产量）

注：-20℃长期保存重亚硫酸盐处理的DNA，或4℃短暂保存。

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