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EpiTect Bisulfite Kit,Qiagen 中文说明书
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二．重亚硫酸处理试剂盒处理DNA(EpiTect Bisulfite Kit,Qiagen ) 注意： 1）每管Bisulfite Mix能用于8个反应，若一次转化少于8个DNA样本，溶解的Bisulfite Mix保存于-20℃（4星期）。 2）DNA Protect Buffer在加入Bisulfite Mix后有绿色变为蓝色（第二步），表明转化反应充分且pH正确。 3）所有离心步骤均在室温下进行。 1.操作前： 1） 缓冲液BW中加入30ml的（96%-100%）酒精，室温保存，在使用前上下颠倒试剂瓶数次混匀。 2） 缓冲液BD中加入27ml的（96%-100%）酒精，2-8℃下保存，在使用前上下颠倒试剂瓶数次混匀。使用完后立即关上瓶盖。 3） 往lyophilized carrier RNA (310μg)中加入310μl的RNase-free水，涡旋震荡使其溶解。分装溶解了的carrier RNA（如50ul/管）。carrier RNA能增强EpiTect 柱对DNA的吸附作用（特别是DNA量少时），如果DNA＞100ng时不需要carrier RNA。 4） 往缓冲液BL中加carrier RNA，体积见表1。如果缓冲液BL中有沉淀，70℃溶解（轻轻晃动）。 5） 将样品和Buffer拿到室温平衡。 6） 孵育器60℃（步骤1），开启PCR仪。 Number of samples 1 4 8 16 24 48 Buffer BL 620 μl 2.5 ml 5 ml 10 ml 15 ml 31 ml carrier RNA solution 6.2 μl 25 μl 50 μl 100 μl 150 μl 310 μl 2.操作步骤： 1） DNA样品解冻。取相应数量的Bisulfite Mix，每管Bisulfite Mix中加800ul的RNase-free水溶解。涡旋至Bisulfite Mix完全溶解（5min左右）。（注意：不要将Bisulfite Mix放到冰上；必要时可以放至60℃孵育再涡旋溶解） 2） 在200ul的PCR管中准备重亚硫酸盐反应液。成分如表： 成分 Volume per reaction (μl) DNA solution (1 ng-2 μg) Variable* (maximum 20 μl) RNase-free水 Variable* Bisulfite Mix (dissolved),步骤1 85 DNA Protect Buffer 35 总体积 140 3） 盖上PCR管，完全混匀反应液。室温存放。（DNA Protect Buffer在加入Bisulfite Mix后有绿色变为蓝色，表明转化反应充分且pH正确） 4） 放至PCR仪上反应。耗时约5小时。 程序如下： 5） 开始运行PCR程序 3.纯化回收转化产物： 6） 瞬离PCR管的转化液，转移至1.5ml的离心管中（若有沉淀，也将其转移）。 7） 每管加入现配的560ul缓冲液BL（含carrier RNA），涡旋混匀后瞬离。 8） 准备对应数量的EpiTect离心柱和收集管，将步骤7中的液体转移至离心柱中。 9） 最大转速离心1分钟。弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中。 10）每个离心柱中加入500ul的缓冲液BW，最大转速离心1分钟。弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中。 11）每个离心柱中加入500ul的缓冲液BD，室温15分钟。（注意：若缓冲液BD中有沉淀，要避免将沉淀转移进去。加完缓冲液BD后要及时盖上盖子） 12）最大转速离心1分钟。弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中。 13）每个离心柱中加入500ul的缓冲液BW，最大转速离心1分钟。弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中。 14）重复步骤13一次. 15）将离心柱放至新的2ml收集管上，最大转速离心1分钟。 16）推荐步骤：将离心柱开盖，放在新的1.5ml离心管上（自备），56℃孵育5分钟。（注：蒸发残余液体） 17）将离心柱放至新的1.5ml离心管上（自备），加入20ul缓冲液EB（小心滴在中央膜上），15000g（12000rpm）1分钟。（注：再用20ul缓冲液EB重复步骤17以提高DNA产量） 注：-20℃长期保存重亚硫酸盐处理的DNA，或4℃短暂保存。 |
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