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青苹果QT金虫 (小有名气)
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[求助]
PCR
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| 用拟南芥基因组PCR启动子，为什么批出来什么都没有呢？？？？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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gwd0312
木虫 (正式写手)
“无冕之王”
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3楼2012-09-11 18:24:42
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 真的很热心啊 2012-09-11 16:01:24
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小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 真的很热心啊 2012-09-11 16:01:24
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PCR扩增不出或者是扩增效率低，模板制备方面主要是下列的影响因素： （1） RT-PCR：请注意，很多基因通过常规RT –PCR方法是很难不增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。 （2）从基因组中扩增：一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高，会影响反应体系中的Mg和pH。 PCR扩增不出或者是扩增效率低，扩增实验方面主要是下列的影响因素： 1) 反应条件不佳：不是最佳反应条件。可重新设计引物，适当调整退火温度，增加镁离子浓度，采用touchdown，或巢式PCR的方法等； 2) 反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号； 3) PCR各种反应成分的降解或加样量不够： a. 引物降解：可通过PAGE电泳检测其完整性； b. 引物设计不佳：重新设计，尽可能避免二聚体和发夹结构等异常情况的出现； c. 模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起； d. 模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生； e. 模板中存在抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。 4) 扩增产物片段过长：一般采用 200－1500bp 的扩增长度 PCR扩增不好的因素很多，上述是汇总的常见影响因素，需要您多方面考虑分析，最好在实验时设置对照来判定原因。如果核查排查了实验过程仍无法发现可能的问题。 |
2楼2012-09-11 15:32:36