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青苹果QT

金虫 (小有名气)

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[求助] PCR

用拟南芥基因组PCR启动子，为什么批出来什么都没有呢？？？？

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【分子生物】EPI帖

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1楼 2012-09-10 17:06:48

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merryyiyi

铜虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 真的很热心啊 2012-09-11 16:01:24

PCR扩增不出或者是扩增效率低，模板制备方面主要是下列的影响因素：
（1） RT-PCR：请注意，很多基因通过常规RT –PCR方法是很难不增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。
（2）从基因组中扩增：一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高，会影响反应体系中的Mg和pH。

PCR扩增不出或者是扩增效率低，扩增实验方面主要是下列的影响因素：
1) 反应条件不佳：不是最佳反应条件。可重新设计引物，适当调整退火温度，增加镁离子浓度，采用touchdown，或巢式PCR的方法等；
2) 反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号；
3) PCR各种反应成分的降解或加样量不够：
a. 引物降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
b. 引物设计不佳：重新设计，尽可能避免二聚体和发夹结构等异常情况的出现；
c. 模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起；
d. 模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生；
e. 模板中存在抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。
4) 扩增产物片段过长：一般采用 200－1500bp 的扩增长度

PCR扩增不好的因素很多，上述是汇总的常见影响因素，需要您多方面考虑分析，最好在实验时设置对照来判定原因。如果核查排查了实验过程仍无法发现可能的问题。