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阿蒙and阵阵

金虫 (初入文坛)

[求助] PCR问题

我想问一下,最近在做基因组的PCR,总是P不出来,用的体系都是之前别人用过的,以前能做出来,但是我做不出来,不知道是哪里的问题,请大家指导一下
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zishilanxuan

金虫 (小有名气)

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感谢参与,应助指数 +1
我也是一样,我的目的基因是1900左右,昨天p出来一个500左右的,顺便问一下,我这个可能是什么问题呢?
2楼2012-09-06 09:40:10
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

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体系是很重要,P不出来也是因为基因不同吧。建议将引物和dNTP的量加大点;另外你的PCR程序也可以做适当调整。祝好运!!
持之以恒、永不放弃!
3楼2012-09-06 09:44:29
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by zishilanxuan at 2012-09-06 09:40:10
我也是一样,我的目的基因是1900左右,昨天p出来一个500左右的,顺便问一下,我这个可能是什么问题呢?

我当初做的时候一次设计了三对引物,如果你的引物特异性不强,可能P出不同的结果,即使你用同样的体系,同样的程序,我碰到过。祝好运!!
持之以恒、永不放弃!
4楼2012-09-06 09:46:51
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)

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体系个人觉得都差不多,关键是你的基因组提取的效果,以及引物的特异性好不好,再就是PCR的程序了。祝好运
5楼2012-09-06 10:45:08
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王平阳

金虫 (正式写手)

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★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-06 13:52:57
如果多次都P不出来,出现问题的可能性就比较广,建议逐一排查,首先用常规基因做PCR,排除PCR试剂可能出现的问题,然后重提DNA,再做,还不行就设计几个退火温度梯度,看是不是程序问题,再不行就是引物问题或者基因组没有目的基因,祝好运!

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没有做不到,只有想不到!
6楼2012-09-06 12:28:55
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阿蒙and阵阵

金虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by 王平阳 at 2012-09-06 12:28:55
如果多次都P不出来,出现问题的可能性就比较广,建议逐一排查,首先用常规基因做PCR,排除PCR试剂可能出现的问题,然后重提DNA,再做,还不行就设计几个退火温度梯度,看是不是程序问题,再不行就是引物问题或者基因 ...

谢谢啦,我先换个基因试试,有问题再请教啊
7楼2012-09-06 14:39:14
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dxli1988

金虫 (小有名气)

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★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-07 13:49:46
这个并不一定是单一因素造成的,你的模板是基因组,那么首先要保证基因组提取的纯度,其次,你的引物设计也占非常重要的位置,Buffer中的镁离子是否加入;再有条件体系的摸索都各不相同,可尝试梯度,touchdownPCR;可尝试小体系如20微升或25微升体系。
逆水行舟,不进则退。
8楼2012-09-06 23:34:33
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)

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你可以做一个梯度试试
每天坚持一点点,终会成功!相信自己
9楼2012-09-07 09:25:14
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huangguoqing

木虫 (正式写手)

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能不能说一下你的体系,引物的Tm值及PCR条件,P不出来的原因有很多,根据你给的信息,现在没办法改进。
10楼2012-09-07 10:17:41
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