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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR问题
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阿蒙and阵阵

金虫 (初入文坛)

[求助] PCR问题

我想问一下，最近在做基因组的PCR，总是P不出来，用的体系都是之前别人用过的，以前能做出来，但是我做不出来，不知道是哪里的问题，请大家指导一下
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1楼 2012-09-06 09:20:25
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zishilanxuan

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也是一样，我的目的基因是1900左右，昨天p出来一个500左右的，顺便问一下，我这个可能是什么问题呢？
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2楼2012-09-06 09:40:10
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
体系是很重要，P不出来也是因为基因不同吧。建议将引物和dNTP的量加大点；另外你的PCR程序也可以做适当调整。祝好运！！
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持之以恒、永不放弃！
3楼2012-09-06 09:44:29
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by zishilanxuan at 2012-09-06 09:40:10
我也是一样，我的目的基因是1900左右，昨天p出来一个500左右的，顺便问一下，我这个可能是什么问题呢？

我当初做的时候一次设计了三对引物，如果你的引物特异性不强，可能P出不同的结果，即使你用同样的体系，同样的程序，我碰到过。祝好运！！
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持之以恒、永不放弃！
4楼2012-09-06 09:46:51
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
体系个人觉得都差不多，关键是你的基因组提取的效果，以及引物的特异性好不好，再就是PCR的程序了。祝好运
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5楼2012-09-06 10:45:08
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-06 13:52:57
如果多次都P不出来，出现问题的可能性就比较广，建议逐一排查，首先用常规基因做PCR，排除PCR试剂可能出现的问题，然后重提DNA，再做，还不行就设计几个退火温度梯度，看是不是程序问题，再不行就是引物问题或者基因组没有目的基因，祝好运!
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

阿蒙and阵阵
没有做不到，只有想不到！
6楼2012-09-06 12:28:55
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阿蒙and阵阵

金虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by 王平阳 at 2012-09-06 12:28:55
如果多次都P不出来，出现问题的可能性就比较广，建议逐一排查，首先用常规基因做PCR，排除PCR试剂可能出现的问题，然后重提DNA，再做，还不行就设计几个退火温度梯度，看是不是程序问题，再不行就是引物问题或者基因 ...

谢谢啦，我先换个基因试试，有问题再请教啊
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7楼2012-09-06 14:39:14
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dxli1988

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-07 13:49:46
这个并不一定是单一因素造成的，你的模板是基因组，那么首先要保证基因组提取的纯度，其次，你的引物设计也占非常重要的位置，Buffer中的镁离子是否加入；再有条件体系的摸索都各不相同，可尝试梯度，touchdownPCR；可尝试小体系如20微升或25微升体系。
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逆水行舟，不进则退。
8楼2012-09-06 23:34:33
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以做一个梯度试试
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每天坚持一点点，终会成功！相信自己
9楼2012-09-07 09:25:14
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huangguoqing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
能不能说一下你的体系，引物的Tm值及PCR条件，P不出来的原因有很多，根据你给的信息，现在没办法改进。
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10楼2012-09-07 10:17:41
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