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植物ROS
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| 我测鱼和蚯蚓ROS时要取线粒体悬浮液前处理是这样的：鱼是取肝脏研磨成液，1000g离20min，取上清，20000g也是离20min，蚯蚓是直接研磨成液，然后剩余步骤同鱼。现在我要做小麦的，我查过植物线粒体的提取方法，太麻烦，而且取完线粒体会对后面的实验有影响，所以想有没有必要那么麻烦呢，我想再采取鱼和蚯蚓那样的前处理方法来做植物的可行性有多少？大家来说说看。 |
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2楼2012-09-05 19:35:09
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但是文献所用的取线粒体的缓冲液中含牛血清蛋白，这样我按文献的方法取到线粒体再重悬浮后去测蛋白会对我的蛋白含量有影响啊（因为我下一步测ROS时要先测下蛋白含量来确定酶液量和探针的量） 我查的文献取线粒体的缓冲液及步骤是这样的，你帮我看看他哪一步或者哪一个试剂是用来破除细胞壁的？（假如他也没有破除细胞壁的步骤那我用动物的方法也不可以吗？简单的研磨再差速离心取不到植物的线粒体？）你帮我看看哈，谢谢你我不懂啊。。。 匀浆缓冲液:50mmol/LTris-HCl， 25mmol/LEDTA，pH8.0， 1.3mo/LNaCl，0.2%BSA，使用前再加L-半胱氨酸和β-巯基乙醇。 称取小麦幼苗叶片, 加入5倍体积预冷的匀浆缓冲液, 用预冷的研钵充分破碎组织, 经6 层纱布过滤, 滤渣加入3 倍体积的匀浆缓冲液 继续破碎,两次滤液合并后分装于15mL 离心管。将滤液用高速冷冻离心机1000 g离心10min; 取上清液2000 g 离心15 min, 并重复此步操作。将得到的上清液18000 g 离心15 min, 弃上清,得到粗线粒体沉淀。向每管沉淀中加入5mL 预冷的匀浆缓冲液, 并将沉淀重悬浮, 18000 g 离心15min, 充分弃掉上清液, 得到较纯的线粒体沉淀。 |
3楼2012-09-06 10:04:18
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【答案】应助回帖
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惭愧，昨天回答你问题的时候没有多想想。 首先，关于细胞壁，我采取的方案是用石英砂研磨，但这个和动物细胞直接研磨估计差别不大，所以细胞壁不是太大的影响因素。而质体存在，由于都是用差速离心，估计也不是大影响因素。你的问题实际上集中在能否换用动物细胞的缓冲液，是么？我依然觉得不可以，尤其是BSA，我认为它的作用是作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用，这样可以保证分离的线粒体完整。同时，BSA的存在还可以抑制脂肪酸及其他脂类物质对线粒体的毒害。所以如果要研究线粒体功能，必须如此。 至于测定线粒体ROS产生，我看过的文章不多，基本上都是用H2DCFDA，不知道你计划怎么做？ 另外，你的方法中用到1.3 mol/l氯化钠，我看到的方法多为甘露醇/蔗糖+BSA+EDTA+Tris-Hcl，为了维持等渗，氯化钠需要这么高的浓度么？你的方法出自什么文献？ |
4楼2012-09-06 19:09:54
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我参照的是一篇硕士论文，他也有文献发出，题目是：小麦线粒体DNA 的高效提取方法 作者是：李文强 我测ROS用的也是DCFH-DA法，我就是研磨完样品，重悬浮，然后去测蛋白含量，根据已经测好的蛋白标准曲线，计算出所需酶液，然后再根据方法里酶液和探针的关系算出需要加的探针含量，然后水浴加热，再去用荧光分光光度计测。 其实我也不是想测定线粒体里的ROS，我就是想测整个的ROS，但是师哥师姐们测蚯蚓ROS时就是这样差速离心说是取线粒体，我就照着他们说的变动了下找到植物取线粒体的方法，再和我们已有的DCFH-DA法相结合来测ROS。 师哥师姐们测鱼和蚯蚓的ROS时的缓冲液就是简单的磷酸缓冲液，并没有加什么BSA来保证线粒体完整，而且最后也测出来了，而且刚发了篇SCI，我感觉我们这种测ROS就是大体测一下吧，看看总体有什么趋势，并不需要测的很精确。 我也问过师哥师姐说你们这么简单的差速离心下就能取到线粒体吗？他们也说不上来，反正他们测ROS就是这么简单的进行下前处理就可以测，现在我做植物想按他们的来，粗略的测下ROS的情况，要是按文献那种方法来取线粒体太麻烦而且那个缓冲液由于加了BSA对我的结果有影响 |
5楼2012-09-06 19:26:09
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6楼2012-09-06 19:38:08
7楼2012-09-06 20:04:07
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【答案】应助回帖
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至于提取方法，我总觉得你提供那篇文献的方法氯化钠浓度偏高，应当是适于获得完整线粒体DNA的，而非完整线粒体。建议你参考更经典的文献，例如： E Petrussa, A Bertolini, J Krajnakova. Isolation of mitochondria from embryogenic cultures of Picea abies (L.) Karst. and Abies cephalonica Loud.: characterization of a channel. Plant cell Rep. 2008, 27: 137-146. Christine A. Robson and Greg C. Vanlerberghe Transgenic Plant Cells Lacking Mitochondrial Alternative Oxidase Have Increased Susceptibility to Mitochondria-Dependent and -Independent Pathways of Programmed Cell Death Plant Physiology, August 2002, Vol. 129, pp. 1908–1920 |
8楼2012-09-06 20:28:43
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a71840584: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-09-06 20:45:29
a71840584: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-09-06 20:45:29
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用荧光显微镜做并不复杂，随便照片好点的文章照着做就行。不明白你所问的前处理是什么？我所说的方法，简单来讲，对样品加试剂处理，加载探针（就是把材料置于探针溶液中），观察，拍照就可以了。具体我随便找了篇文章，你可以参考一下 Two Distinct Sources of Elicited Reactive Oxygen Species in Tobacco Epidermal Cells Andrew C. Allan and Robert Fluhr The Plant Cell, Vol. 9, 1559-1572 你用含BSA的缓冲液离心，样品中就会多少有外来蛋白，如果没有，BSA怎么发挥保护作用？如果你对结果要求不是特别严格，就找你说的做吧，但我很怀疑这样的结果怎么合理的写在文章中。 |
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a718405849楼2012-09-06 20:37:54
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