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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 求助！关于革兰氏阳性菌DNA提取的问题
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weiyasong

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

（一）细菌总DNAD 提取
革兰氏阳性菌DNA提取方法(提取基因组DNA)
1. 3-6ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 弃上清
2. 加0.5ml TE悬浮沉淀,并加75μl 溶菌酶（20mg/ml）溶液，40°C保温30分钟
3. 加50μl, 10% SDS, 5μl 蛋白酶K （20mg/ml）,混匀, 37℃保温30分钟
4. 加0.75ml, 5mol/L NaCl, 混匀
5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管
6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 静置10分钟，5000转离心10分钟，转移上清到干净管中。
7. 加2倍体积乙醇沉淀DNA, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，离心沉淀DNA
8. 70%乙醇漂洗DNA后, 吸干, 用30-50μl TE溶解DNA, -20℃保存

可以试试，我用的这个方法，感觉挺好使！
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11楼2012-08-30 08:54:00
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limin2012

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

胶质物质加无菌水可以溶吗？DNA浓度太大也会吸不出来。
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12楼2012-08-30 10:08:17
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jenoscard

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by weiyasong at 2012-08-30 08:54:00
（一）细菌总DNAD 提取
革兰氏阳性菌DNA提取方法(提取基因组DNA)
1. 3-6ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 弃上清
2. 加0.5ml TE悬浮沉淀,并加75μl 溶菌酶（20mg/ml）溶液，40°C保温30分钟
3. 加50μl,  ...

我用的是试剂盒  不过前面应该可以参考下 写啦
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13楼2012-08-30 10:38:01
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jenoscard

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by limin2012 at 2012-08-30 10:08:17
胶质物质加无菌水可以溶吗？DNA浓度太大也会吸不出来。

没试过  就是很大一坨在里面 透明的  也不像DNA
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14楼2012-08-30 10:40:01
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limin2012

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你可以试一下。或用乳酸菌特有的引物PCR跑电泳看一下有条带吗？
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15楼2012-08-30 12:59:51
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spice

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我加入溶菌酶在55度下20分钟，提出来了，看看加入溶菌酶后可以适当升点温看行否、、、
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16楼2012-08-30 13:42:45
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jenoscard

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by ybfang at 2012-08-29 11:22:08
不用挑太多的。一两个菌落足以...

我用的液体培养基呢
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17楼2012-09-01 10:17:50
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jenoscard

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by spice at 2012-08-30 13:42:45
我加入溶菌酶在55度下20分钟，提出来了，看看加入溶菌酶后可以适当升点温看行否、、、

怎么高不会失活哦？
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18楼2012-09-01 10:18:55
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spice

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
18楼: Originally posted by jenoscard at 2012-09-01 10:18:55
怎么高不会失活哦？...

根据结果还没有完全失火
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19楼2012-09-01 12:49:11
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木森林coco

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
scelab: 金币+5, 鼓励新虫，多多交流哦~ 2012-09-10 12:10:49
我以前也遇到过你说的一坨的问题，确实是菌液量太大了，3-5ml足以。不知道跟你的情况一样不
赞一下(1人) 回复此楼
努力就会有收获
20楼2012-09-09 15:54:36
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