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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » PCR验证
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KO奋斗

金虫 (正式写手)

[求助] PCR验证

从原始菌中提取一NA基因，重组到大肠杆菌BL21，产生的酶有活性，但是分子量（110Kb)与原始菌(67Kb)的不同，根据重组菌的目的序列设计引物去PCR原始菌，没有条带。现不知道该从哪里下手解决这个问题。希望大家给于帮助啊
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1楼 2012-08-16 17:07:16
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674515734

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流！ 2012-08-16 20:16:36
KO奋斗: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-08-17 08:42:40
你的基因片段是不是插入到大肠杆菌某个基因内部了，导致形成了了一个融合蛋白。
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在卑微中活出精彩，在短暂中寻求永恒。。。
2楼2012-08-16 17:49:24
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KO奋斗

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 674515734 at 2012-08-16 17:49:24
你的基因片段是不是插入到大肠杆菌某个基因内部了，导致形成了了一个融合蛋白。

谢谢，应该不是啊，是质粒上，没活性还很高，就是分子量不统一啊
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3楼2012-08-16 18:47:58
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woshizhufeng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
重新设计一下引物试试吧，多做几次
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4楼2012-08-17 00:04:05
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果表达的蛋白分子量不对，并且你的引物还扩不出来，那说明你连接的片段不是你的基因。再重复连接一次，如果还是出现这个结果，并且如果楼主确定你的连接片段是你的基因的话，楼主可以把这个蛋白测个序，比对下看到底是什么地方出的问题，是否真的像一楼说的那样融合蛋白，个人觉得不可能，如果是真的，那真是个新现象哈，
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KO奋斗
5楼2012-08-17 07:37:01
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KO奋斗

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by woshizhufeng at 2012-08-17 00:04:05
重新设计一下引物试试吧，多做几次

我试了好几个引物了啊，谢谢
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6楼2012-08-17 08:39:54
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KO奋斗

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-17 07:37:01
如果表达的蛋白分子量不对，并且你的引物还扩不出来，那说明你连接的片段不是你的基因。再重复连接一次，如果还是出现这个结果，并且如果楼主确定你的连接片段是你的基因的话，楼主可以把这个蛋白测个序，比对下看到 ...

谢谢，只能先试试看了啊
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7楼2012-08-17 08:42:55
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
1、首先确定下你用的什么质粒，会不会质粒上有融合蛋白。
2、对重组质粒进行测序，进行比对，看有何异同。
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8楼2012-08-18 19:29:38
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