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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 启动子替换
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清水一杯

新虫 (初入文坛)

[求助] 启动子替换

我最近准备做一个试验，希望通过替换出发菌株的启动子，构建一株目的基因簇高水平表达的工程菌。
基本试验设计：利用double cross-over同源整合，在外源启动子两侧分别加入靶标启动子的5'和3'序列。
问题：利用上述方法，电激转化出发菌株后能否成功获得启动子被替换的重组工程菌？
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1楼 2012-08-15 17:14:49
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-15 20:49:35
貌似是可以的，算是一个同源重组。但是需要经过单交换--双交换的过程（也可能直接双交换一步完成，但是概率很低），问题是你要电转化的质粒能不能在宿主里稳定存在、传代。另外上游和下游同源序列的长度在几百~1000bp比较合适。
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
2楼2012-08-15 18:59:20
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robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-15 20:49:42
是相当于同源重组，但还应该在替换的启动子上游加上筛选标记。
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3楼2012-08-15 20:19:09
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默默的等待

金虫 (正式写手)
感觉有点难度 首先你替换的启动子能能保证在此菌株中一定能高表达吗？做预实验没 ，再次启动子片段大小啊   个人感觉
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4楼2012-08-16 16:39:11
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406856929

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

应该是可以的，采用双交换后，不需要进行电转化，可通过接合转移的方法，让启动子自行替换，但是这样需要一个遗传操作质粒来帮助接合上去，这个质粒需要在目的菌里面能够存活，质粒是关键
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5楼2013-01-16 13:33:41
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gywyl1977

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

想提高表达量的基因簇如果不大，可以先在质粒上用强启动子携带基因簇表达，看看有没有效果。如果很大，仅仅替换一个启动子是不可能带动这么多基因的。
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6楼2013-01-16 14:18:14
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