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清水一杯

新虫 (初入文坛)

[求助] 启动子替换

我最近准备做一个试验,希望通过替换出发菌株的启动子,构建一株目的基因簇高水平表达的工程菌。
基本试验设计:利用double cross-over同源整合,在外源启动子两侧分别加入靶标启动子的5'和3'序列。
问题:利用上述方法,电激转化出发菌株后能否成功获得启动子被替换的重组工程菌?
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xbl3688

银虫 (正式写手)

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rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-15 20:49:35
貌似是可以的,算是一个同源重组。但是需要经过单交换--双交换的过程(也可能直接双交换一步完成,但是概率很低),问题是你要电转化的质粒能不能在宿主里稳定存在、传代。另外上游和下游同源序列的长度在几百~1000bp比较合适。
生活的乐趣在于善于发现美,学会欣赏美
2楼2012-08-15 18:59:20
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robert-RBT

木虫 (小有名气)

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rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-15 20:49:42
是相当于同源重组,但还应该在替换的启动子上游加上筛选标记。
3楼2012-08-15 20:19:09
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默默的等待

金虫 (正式写手)

感觉有点难度 首先你替换的启动子能能保证在此菌株中一定能高表达吗?做预实验没 ,再次启动子片段大小啊   个人感觉
4楼2012-08-16 16:39:11
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406856929

新虫 (初入文坛)

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应该是可以的,采用双交换后,不需要进行电转化,可通过接合转移的方法,让启动子自行替换,但是这样需要一个遗传操作质粒来帮助接合上去,这个质粒需要在目的菌里面能够存活,质粒是关键
5楼2013-01-16 13:33:41
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gywyl1977

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

想提高表达量的基因簇如果不大,可以先在质粒上用强启动子携带基因簇表达,看看有没有效果。如果很大,仅仅替换一个启动子是不可能带动这么多基因的。
6楼2013-01-16 14:18:14
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