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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 4%PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）250bp处条带出现扭曲，求助！
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coal@live.cn

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by q307078056 at 2012-08-07 16:33:54
1、请更换你的缓冲液，缓冲液浓度不均匀会引起电场不稳，很容易导致胶边缘的核酸出现变形

2、核酸的定性要做好，时间做足··

3、灌胶应一次成型，避免漏胶跟二次补胶。

4、TEMED别过量

嗯，缓冲液的确有过好几次了，是个问题。但是电场不稳不会导致如此有规律的扭曲（全部在250bp左右，基本呈一条直线）。

我这个是非变性PAGE，样本不用变性。

这点没问题，是一次成型的。

TEMED用量每50ml胶液加50微，应该没过量，我灌完胶后管中所剩胶液还是呈水流状。
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11楼2012-08-08 19:54:02
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leguminosae
12楼2012-08-08 20:02:28
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coal@live.cn

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-07 19:18:48
1，调低电泳电压。
2，电泳前确保胶下部没有气泡。
3，夹夹子时两面过紧或过松也容易出现类似现象。
此外,楼主PCR条件还需要调整，你的整个泳道几乎都是SMEAR.

10cm长的胶，用DYY-6C型电泳仪，加120V电压（相当于6V/cm），应该不算高吧？

下部无气泡，玻璃板下面的缺失部分是用来封胶（封槽子）的琼脂糖，显影前我就剥掉了。

槽子受力不均可以部分解释第一张图，但是第二张图没这个问题，另外再提一下，我关注的问题是：为什么扭曲会如此有规律地出现在在250bp左右，且基本呈一条直线。这一点受力不均可解释不了。
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13楼2012-08-08 20:03:40
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coal@live.cn

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mlanqiang at 2012-08-07 20:17:21
溴酚蓝可能已经过期了，重新配一下看看。

溴酚兰这周刚配，但没过滤。
另外我溴酚兰的添加量是样本的1/2体积。
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14楼2012-08-08 20:05:30
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coal@live.cn

新虫 (小有名气)
最近试了下6%的非变性胶（1L用的是4%），发现扭曲线（即在该直线上所有泳道统一发生扭曲和压缩，由图可见）转移到了100bp左右。

现在我也开始怀疑这个现象是溴酚兰（其中的蔗糖）导致的，因为4%的胶中扭曲出现在250bp，而6%的胶中出现在100bp，跟溴酚兰的浓胶中的等效片段小于稀胶这个现象相一致。

不知各位还有什么高见，这个问题又该如何解决？

6%非变性胶，SRAP
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15楼2012-08-08 20:29:57
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xudabin98

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你啥都不要怀疑，是你的电压出了问题，你下面封胶时没有封好！导致电压不均一才出现这种情况。
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16楼2012-08-09 16:45:52
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coal@live.cn

新虫 (小有名气)
有结果了，的确是溴酚兰的问题，有图为证。

以下两板来自同一个电泳槽（所以跟电压和缓冲液无关），跑的是SRAP分子标记，两板的marker都是DL2000，可以发现用旧溴酚兰上样的那板扭曲依旧，且扭曲线（略小于250bp）下方的条带已经模糊不清；而用新溴酚兰的那板不仅没有扭曲线，100bp处的条带照样清晰可见。

wu_shiyong和mlanqiang说得没错，在此特别感谢二位！

另外说明一下旧溴酚兰是用楼上组培用的廉价蔗糖配的，而新溴酚兰是用分析纯级蔗糖配的，看来分子实验果然不能用便宜货啊。

旧溴酚兰，6%非变性胶



新溴酚兰，6%非变性胶
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17楼2012-08-09 22:08:49
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wu_shiyong

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by coal@live.cn at 2012-08-08 19:35:24
嗯，我用的是自配的loading buffer（0.25%溴酚兰，40%蔗糖），上样前每份样品添加1/2体积的loading buffer，跑电泳时溴酚兰的确是呈一条直线（有些粗而淡），但这不是很正常吗？

溴酚兰是这周刚配的，但是没过滤 ...

你换用别人的试试！不用过滤，关键得全部溶解！
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低调稳重务实内敛---------------残
18楼2012-08-09 23:13:30
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coal@live.cn

新虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by wu_shiyong at 2012-08-09 23:13:30
你换用别人的试试！不用过滤，关键得全部溶解！...

谢谢，我问题已经解决了，的确是溴酚兰不对。
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19楼2012-08-10 11:37:29
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liupengxues

银虫 (初入文坛)
你可以试试低电压，降低一下溶液的温度
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一寸光阴一寸金，寸金难买寸光阴。
20楼2015-06-26 14:04:46
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