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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何确定pcr产物是目的片段
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damaomao

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
11楼2012-08-06 16:22:34
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主是否你的模板是CDNA？如果是CDNA因为内含子的原因倒是可以解释的通。无论如何，测序后比对是最准确的。
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12楼2012-08-06 18:42:00
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雪强爱信

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-06 18:42:00
楼主是否你的模板是CDNA？如果是CDNA因为内含子的原因倒是可以解释的通。无论如何，测序后比对是最准确的。

我的模板是原核基因组DNA，本人总感觉跟marker有关系，换了marker后长度也变了！郁闷了，我用的是1.2%的胶，marker是500bp ladder
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13楼2012-08-07 08:52:28
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雪强爱信

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ghs25372216 at 2012-08-06 11:01:08
要是你P出来差这么多，应该肯定不是你的目的片段，除非你用的染料迁移很大。建议你再审查下引物是否没问题，在一个相对大的范围内做个温度梯度PCR，理论上说600bp应该很容易P出来，况且你的引物又是特异的，建议你还 ...

染料跟迁移率有关系吗？我以为影响迁移是电场强度、核酸分子量和构象、胶浓度。你说引物如果出现问题，最大的问题是不是发生错配？其它的我尽量遵循设计引物的原则。
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14楼2012-08-07 09:00:01
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雪强爱信

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gungunak47 at 2012-08-06 14:35:25
是不是marker不准呢  换个marker试试

换了marker，还真不一样
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15楼2012-08-07 09:00:44
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雪强爱信

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wygcsu at 2012-08-06 09:36:01
可以去测序，然后和你的目的序列比对！！！

顺便问一下，测序的话用PCR产物，要多少量？
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16楼2012-08-07 09:02:49
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wygcsu

木虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 雪强爱信 at 2012-08-07 09:02:49
顺便问一下，测序的话用PCR产物，要多少量？...

一般是30-50uL就可以了，具体的你可以问测序公司，现在的好像是不需要你自己纯化了，直接PCR产物就可以了。
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17楼2012-08-07 09:27:57
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ghs25372216

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，欢迎常来 2012-08-07 15:46:25
本帖内容被屏蔽
18楼2012-08-07 10:04:32
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zff912

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
简便的方法是换个marker  如DL2000  如果大于500就应该是了
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No matter how far you may fly, never forget where you come from
19楼2012-08-07 15:00:55
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王礼鹏

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

测序最好的了，也就600bp，一次就够了！！省时省力！！我觉得可以二次PCR，就是凝胶回收DNA，再去P一次看看。或者设个温度梯度看看。仅供参考！
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20楼2012-08-09 13:34:45
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