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guoxinkun1

金虫 (初入文坛)

[求助] 以1800的线性DNA做模板PCR怎么P不出来

俺是以融合PCR出来的1800bp的线性片段做模板做PCR的，p了好几次就是p不出来，请问是怎么回事啊？用线性片段做模板理论上行不行啊，是不是非得联T载做成环状质粒啊？（看小木虫上有用Dpn1的，Dpn1是什么东西啊...）各位大侠，求助啊
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勇往直前
1楼 2012-07-25 17:03:12
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励积极分享经验 2012-07-26 15:24:20
没有必要连载体也可以P出来的啊。你的反应体系，反应条件是什么，说的具体一点，P不出来的原因有很多，退火温度，酶，引物等等都会对结果有影响的。

Dpn1是一种酶，作用是降解消除模板质粒DNA的。但是前提是你的模板是经过转化提质粒得到的，因为Dpn1是甲基化依赖型的，模板DNA带有甲基才会被降解消除，而像你这样的线性DNA一般是用不到这种酶的。
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2楼2012-07-26 09:17:02
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wu_shiyong

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不用连载体，你融合过后验证过吗？
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

guoxinkun1
低调稳重务实内敛---------------残
3楼2012-07-26 09:31:21
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guoxinkun1

金虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by wu_shiyong at 2012-07-26 09:31:21
不用连载体，你融合过后验证过吗？

问一下怎么验证啊，跪求啊
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勇往直前
4楼2012-07-26 17:06:16
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guoxinkun1

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gelois at 2012-07-26 09:17:02
没有必要连载体也可以P出来的啊。你的反应体系，反应条件是什么，说的具体一点，P不出来的原因有很多，退火温度，酶，引物等等都会对结果有影响的。

Dpn1是一种酶，作用是降解消除模板质粒DNA的。但是前提是你的 ...

反应体系是50微的，退火是57度，酶还是Premix PrimeSTAR HS 这个高保真酶，详解啊，求助....
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勇往直前
5楼2012-07-26 17:07:35
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wu_shiyong

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by guoxinkun1 at 2012-07-26 17:06:16
问一下怎么验证啊，跪求啊...

跟连接前的跑胶 最好还是测序
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低调稳重务实内敛---------------残
6楼2012-07-26 17:14:33
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84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
guoxinkun1: 金币+66, 谢啦 2012-07-29 07:31:22
1.先确定模板木有任务问题，建议还是测序+跑电泳一起。
2.我之前也用过一段大概5000bp的片段作为模板，是可行的，建议检查下引物，进行温度梯度了吗？如果不行，建议建议模板浓度，再P。
3.产物有杂带吗？多吗？如果杂带多，建议检查下引物，重新设计。
希望对你有帮助。
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7楼2012-07-26 23:12:57
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by guoxinkun1 at 2012-07-26 17:07:35
反应体系是50微的，退火是57度，酶还是Premix PrimeSTAR HS 这个高保真酶，详解啊，求助.......

我们用的也是这种酶，如果你确定你的模板没有问题的话，建议进行下温度梯度PCR，从50到60℃，应该是可以P出来的，我到现在貌似没有没P出来的，最多就是条带有点稀，但还是可以用的。多试几次吧。
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8楼2012-07-27 08:48:37
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sd3824289

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶切鉴定一下，最好测序！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
9楼2012-07-27 15:53:47
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浪子1989

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gelois at 2012-07-27 08:48:37
我们用的也是这种酶，如果你确定你的模板没有问题的话，建议进行下温度梯度PCR，从50到60℃，应该是可以P出来的，我到现在貌似没有没P出来的，最多就是条带有点稀，但还是可以用的。多试几次吧。...

高人啊 没有P不出来过，你让我这一直P不出来的情何以堪
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一切得靠自己努力
10楼2013-03-29 20:58:39
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