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guoxinkun1

金虫 (初入文坛)

[求助] 以1800的线性DNA做模板PCR怎么P不出来

俺是以融合PCR出来的1800bp的线性片段做模板做PCR的,p了好几次就是p不出来,请问是怎么回事啊?用线性片段做模板理论上行不行啊,是不是非得联T载做成环状质粒啊?(看小木虫上有用Dpn1的,Dpn1是什么东西啊...)各位大侠,求助啊
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勇往直前
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by guoxinkun1 at 2012-07-26 17:07:35
反应体系是50微的,退火是57度,酶还是Premix PrimeSTAR HS 这个高保真酶,详解啊,求助.......

我们用的也是这种酶,如果你确定你的模板没有问题的话,建议进行下温度梯度PCR,从50到60℃,应该是可以P出来的,我到现在貌似没有没P出来的,最多就是条带有点稀,但还是可以用的。多试几次吧。
8楼2012-07-27 08:48:37
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励积极分享经验 2012-07-26 15:24:20
没有必要连载体也可以P出来的啊。你的反应体系,反应条件是什么,说的具体一点,P不出来的原因有很多,退火温度,酶,引物等等都会对结果有影响的。

Dpn1是一种酶,作用是降解消除模板质粒DNA的。但是前提是你的模板是经过转化提质粒得到的,因为Dpn1是甲基化依赖型的,模板DNA带有甲基才会被降解消除,而像你这样的线性DNA一般是用不到这种酶的。
2楼2012-07-26 09:17:02
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wu_shiyong

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
不用连载体,你融合过后验证过吗?

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

低调稳重务实内敛---------------残
3楼2012-07-26 09:31:21
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guoxinkun1

金虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by wu_shiyong at 2012-07-26 09:31:21
不用连载体,你融合过后验证过吗?

问一下怎么验证啊,跪求啊
勇往直前
4楼2012-07-26 17:06:16
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