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wjj1139

新虫 (初入文坛)

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专业: 植物病理学

[求助] 电泳图怎么全是引物二聚体？求解

求大家给我分析一下，为什么电泳图上全是引物二聚体，而我们的目的条带没有出来，退火温度已经很低了。。

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附件 1 : 7.24.tif

2012-07-24 16:50:15, 2.74 M

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1楼2012-07-24 16:53:15

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

2010013808

铜虫 (初入文坛)

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专业: 生物大分子结构与功能

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-13 15:08:58

复制的的别人的
1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；
2. 可能模板有问题；
3. 模板浓度过小，适当加大模板量；
4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；
6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；
7. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
8. 增加循环数；
9. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；
10. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。
11. 以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50-100倍