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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因敲除
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

[交流] 基因敲除

向各位大侠请教一下基因敲除的知识噶。我是做真菌的基因敲除，这个丝状真菌是多核的，我使用原生质体介导进行同源替换的方法进行。我敲的这个基因验证了将近两百个转化子了，但是都是杂合子。也就是说可能只替换了部分核的DNA，没有实现全部核替换的纯合转化子。这个基因在我的课题中必须敲掉呢，所以很是伤心。请教各位同行给予指点啊，金币多多的送啊。
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1楼 2012-07-09 21:20:54
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凡子1985 at 2012-07-09 23:47:48
这个是个麻烦事 能不能用杂合子 换一个marker继续敲除呢 这样应该可以吧 或者诱导某个时期少核时进行敲除 真菌敲除还是挺容易操作

用杂合子来敲除就要换一个抗性标记哈，这样好像是可行的，不过我的杂合子也表现出了不一样的表型，主要从生长速度和菌落形态来看，如果是这样的话就每种都选一下吧。这样倒是个好方法呢，我会试一下的，非常感谢您了。这个菌倒是不知道如何诱导少核呢，我先想想第一种方案吧
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3楼2012-07-10 08:39:36
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凡子1985

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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linxi8579: 金币+8 2012-07-10 08:39:49
这个是个麻烦事 能不能用杂合子 换一个marker继续敲除呢 这样应该可以吧 或者诱导某个时期少核时进行敲除 真菌敲除还是挺容易操作
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2楼2012-07-09 23:47:48
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
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linxi8579: 金币+3 2012-07-10 21:34:52
使用孢子进行遗传转化，可以避免该问题...
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4楼2012-07-10 12:27:09
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-07-10 12:27:09
使用孢子进行遗传转化，可以避免该问题...

还要补充一点呢，有个很不好的现象是我们这个菌孢子里面也是多核呢，哎
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7楼2012-07-10 21:34:09
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
linxi8579: 金币+1 2012-07-11 08:44:50
引用回帖:
7楼: Originally posted by linxi8579 at 2012-07-10 21:34:09
还要补充一点呢，有个很不好的现象是我们这个菌孢子里面也是多核呢，哎...

哪种真菌？孢子一般都是单核...你可以使用DAPI染色观察确认下...
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8楼2012-07-11 00:33:41
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
linxi8579: 金币+2 2012-07-11 08:47:08
你的核心问题，我感觉是发生了单交换，而非双交换获得基因敲除...
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9楼2012-07-11 00:35:26
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-07-11 00:33:41
哪种真菌？孢子一般都是单核...你可以使用DAPI染色观察确认下......

我们这个菌是少孢节丛孢，孢子是多核是已经确定了的呢。
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10楼2012-07-11 08:44:43
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-07-11 00:35:26
你的核心问题，我感觉是发生了单交换，而非双交换获得基因敲除...

我觉得杂合子的原因可能是只在少数核中发生了基因替换，有的核敲除片段没有进去或者进去了没有发生替换吧。您说的单交换和双交换如何推断呢？
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11楼2012-07-11 08:46:58
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
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linxi8579: 金币+3 2012-07-12 15:40:08
把多核的文献发给我greatzhangtao@hotmail.com。2年不做真菌，或许有些知识我生疏了。我以前只做木霉。如果孢子多核，不行的话只能用RNAi。
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12楼2012-07-11 12:48:36
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-07-11 12:48:36
把多核的文献发给我greatzhangtao@hotmail.com。2年不做真菌，或许有些知识我生疏了。我以前只做木霉。如果孢子多核，不行的话只能用RNAi。

关于我们这个菌的多核的文章我现在手上没有呢，多核的现象我们就是知道而已，是很多年前做鉴定的老科学家们的工作了。很多真菌都多核的，我们这个菌孢子也是多核。我想先试一下换个筛选标记对杂合子进行基因敲除看看吧。谢谢您啦。
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13楼2012-07-12 15:39:59
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-07-11 12:48:36
把多核的文献发给我greatzhangtao@hotmail.com。2年不做真菌，或许有些知识我生疏了。我以前只做木霉。如果孢子多核，不行的话只能用RNAi。

请问您现在是做什么的，在哪个单位啊？
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14楼2012-07-12 15:40:31
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
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14楼: Originally posted by linxi8579 at 2012-07-12 15:40:31
请问您现在是做什么的，在哪个单位啊？...

现在中科院，做海洋放线菌抗肿瘤次级代谢产物生物合成途径研究。
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15楼2012-07-12 16:26:16
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
只要有一个核发生双交换，在选择压力下，反复生孢，传5代左右，再用PCR筛选试试...前提是双交换发生，而不是单交换...你应该设置为求助贴..
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16楼2012-07-12 16:29:01
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-07-12 16:29:01
只要有一个核发生双交换，在选择压力下，反复生孢，传5代左右，再用PCR筛选试试...前提是双交换发生，而不是单交换...你应该设置为求助贴..

哦，好的，谢谢啦。传代的方法我倒是也考虑过呢，不过不同的杂合子表型也有不一样呢，是每一种都要选吗？
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17楼2012-07-12 22:00:58
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-07-12 16:26:16
现在中科院，做海洋放线菌抗肿瘤次级代谢产物生物合成途径研究。...

哦，我们学校的李文均也做些这方面的内容呢
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18楼2012-07-12 22:03:20
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
★
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云大的啊...怎么会有那么多表型？
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19楼2012-07-13 14:11:56
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-07-13 14:11:56
云大的啊...怎么会有那么多表型？

倒也不太多，只是从生长速度和形状来看有些差别。我想也许变化不大的杂合子是可以选的吧。
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20楼2012-07-14 16:06:03
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一条大蠢狗

新虫 (初入文坛)
★
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哥们，我也遇到了相同的状况，你的解决了么
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21楼2014-05-28 11:29:45
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)
解决了么？楼主
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22楼2014-05-28 14:41:55
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-05-28 14:41:55
解决了么？楼主

额，没有呢，敲了好几年了，准备放弃了
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23楼2014-06-02 09:24:33
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混合配搭

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问您做原生质体的制备吗？可以分享一下吗？35723668@qq.com
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24楼2015-04-08 17:53:00
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rabbit12510

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by linxi8579 at 2012-07-10 08:39:36
用杂合子来敲除就要换一个抗性标记哈，这样好像是可行的，不过我的杂合子也表现出了不一样的表型，主要从生长速度和菌落形态来看，如果是这样的话就每种都选一下吧。这样倒是个好方法呢，我会试一下的，非常感谢您 ...

楼主，你好，我想问一下你的敲除成功了吗
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25楼2019-01-05 19:14:35
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长发小魔女

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主，想请教一下，你们的菌就是所有的基因敲除都不成功是吗？我的情况是我的基因总是敲不掉，但是其他人敲除别的基因很快就敲掉了，我们用的原始菌株是一样的，很奇怪。

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26楼2019-05-30 01:04:06
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6698

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好我也筛选出来了灰葡萄孢菌也是多核的 表型变化大 但是pcr验证不对

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27楼2021-03-23 09:07:30
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zhengkning5楼
2012-07-10 13:06   回复  
世外清风6楼
2012-07-10 18:20   回复  
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