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神经元细胞microRNA原位杂交 已有1人参与
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想在培养的神经元细胞上直接做microRNA原位杂交，现在已经从exiqon购买回地高辛双标的探针，如果对照下面的在组织切片上的操作流程，有哪些步骤是需要删减、增补或修改的？ 1. 脱蜡和水化：二甲苯2次，每次10分钟；依次经100%、95%、80%、75%乙醇和DEPC-H2O各一次，每次5分钟。 2. 0.2M HCl室温处理5分钟。 3. PBS洗3次，每次5分钟。 4. 蛋白酶K（40μg/ml）室温孵育20分钟。 5. 含0.2%甘氨酸的PBS洗3次，每次5分钟。 6. 4%多聚甲醛固定10分钟。 7. PBS洗2次，每次5分钟。 8. 醋酸酐和三乙醇胺溶液室温孵育10分钟。 9. PBS洗2次，每次5分钟； 10.57℃预杂交2小时。 11.57℃杂交4小时。（57℃：探针的杂交温度） 12.5×SSC洗2次，每次20分钟。 13.50%去离子甲酰胺/2×SSC 50℃洗3次，每次20分钟。 14.TBST洗5次，每次5分钟。 15.室温封闭1小时。 16.抗地高辛一抗（1：500）4℃孵育过夜。 17.TBST洗4次，10分钟。 18.BCIP/NBT染色液缓冲液洗2次，每次10分钟。 19.BCIP/NBT暗处染色约2小时。 20.TE（pH8.0）洗两次终止反应. 21.水洗残液，脱水、封片。 有几个问题想询问一下： (1)直接在种有神经元细胞的玻片上操作，应该不需要进行脱蜡和水化吧？那从哪一步切入比较合适，或是前面的步骤有什么是需要修改的？ (2)步骤2中HCl和步骤4中蛋白酶K的作用各是什么？ (3)在杂交之前，探针需要热变性不？变性温度是多少？ (4)TE终止反应，可以用别的溶液替代吗？ 感谢大家耐心地看到最后，希望走过路过的能多多赐教！不胜感激啊！ |
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