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xiaohuibit银虫 (小有名气)
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方法验证实验这么做对吗？
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LOD和LOQ的做法： QL = 10 σ /S DL=3.3σ /S where σ = the standard deviation of the response S = the slope of the calibration curve The slope S may be estimated from th ... 谢谢您的回复。我本来是分析的门外汉，但是现在人在国外，只能做这方面的研究。快被所谓的方法验证理论逼疯了，已经接近两个月了，我查了很多资料，但是发现几乎所有的人对验证过程的细节均一带而过，就给出一个什么加标实验，回收率的表格，有的甚至就一句话。所以我估计我的问题不在于看资料少，而在于细节东西心里没把握。 比如我用荧光淬灭剂先去抑制一种染料的荧光，然后在这个体系中加入待检物后发现荧光重新增强。那么我要验证我提出的这个分析方法，照我的理解是不是应该按以下步骤进行： １首先根据先期实验结果，选取几个浓度点(如７个点，每个重复测３次，取平均值)，测试荧光强度，然后做用荧光值或者荧光面积值(顺便问一下用面积计算，应当取什么区间，有没有标准规定，还是自己看着办)为纵轴，以浓度为横轴，做出线性关系来。在我理解这个线性关系就是所谓的标准曲线。而曲线不一定非要过零点吧。如果有截距和斜率，貌似斜率就是上述公式中的S,那么截距是不是没什么用？还是也有其他用处？ ２得到线性相关系数大于３个９的工作曲线之后，是不是就可以做检出限了？具体方法我觉得好像是取一个低浓度的试样，重复检测１１次，然后得到１１个不同的荧光强度，是把这１１个荧光值直接求标准方差，然后除以斜率再乘以系数就可以得到检测限了吗？(就是用你给出的两个公式)还是应该将这１１个荧光强度值代入工作曲线，得出１１个浓度值，求浓度的标准方差呢？(或许两者是一个值，本人数学比较差，所以不清楚)。因为我始终搞不明白σ /S的比值为什么会是浓度的量纲呢？费解呀。。。。到底中间过程是怎样呢？跪求高手指教！ ３在得到检出限的基础上，我是不是可以做加标回收率试验了。具体方法是在一个已知待测物含量的样品中加入已知浓度一定量的待测样，然后就得到一个新的荧光值，代入工作曲线，得到加样之后的浓度，回收率的求法是用加样测得的浓度算出质量减去未加样前待测物质量的差再除以加入的待测物质量，对吗？那么所谓的RSD又是怎么回事呢？是每个加样浓度重复测５次，计算出的recovery的相对标准偏差吗？还是浓度的偏差？不清楚呀。。。。 ４用浓度的标准方差或者相对标准方差是不是就能说明精密度和准确度了，还是又需要做什么其他实验？ ５ 如果想发表文章，是不是必须用生物体的样本(比如尿样或者血清样本)进行稀释后检测，才能最终确认方法的正确性。也就是检验一下方法的抗干扰能力。对不对呢？ 以上是本人的拙见，我学习了很久还是不得精髓，时间紧迫，还希望各位从事这方面研究的专业人士不啻赐教，在下感激不尽！！！ |
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【答案】应助回帖
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1．准确度 该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求根据有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3％的杂质溶液），分别测定其含量,将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。 该项目的可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。 2．线性 线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为： 在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。 可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。 3．精密度 1）重复性 配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。 2）中间精密度 配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于20%。 4．专属性 可接受的标准为：空白对照应无干扰，该杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于2.0。 5．检测限 杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。 6．定量限 杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。 7．耐用性 分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化±5nm、流速相对值变化±20％以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。 可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内。 8、系统适应性 配制6份相同浓度的杂质溶液进行分析，该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外，杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，理论塔板数应符合质量标准的规定。 9．溶液稳定性 按照分析方法分别配置对照品溶液与供试品溶液，平行测定两次主成分与杂质的含量，然后将上述溶液分别贮存在室温与冰箱冷藏室（4℃）中，在1、2、3、5和7天时分别平行测定两次主成分与杂质的含量。 可接受的标准为：主成分的含量变化的绝对值应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内，并不得出现新的大于报告限度的杂质。 我就按照这做的。 |
7楼2012-11-07 21:00:25
xiaohuibit
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2楼2012-06-06 02:56:36
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发现楼主问题真是不少啊3楼2012-06-06 09:09:31
xbqewpq
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【答案】应助回帖
xiaohuibit: 回帖置顶 2012-06-10 04:24:43
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这个范围就是你要检测的样品浓度的上下区间，比如50%~150%（你说的七个点就在这个范围）。截距和斜率都没用。至少在液相是没用到。 2、检测限是你检测到的最低样品浓度。它不需要重复测。一次就够。 3、回收率做法是对的。但要做不同浓度的回收率，比如样品浓度的，50%、80%、120%。三个浓度，每个做三次。RSD就是测得的九个结果的相对标准偏差。RSD是一个百分比。没有单位。 4、精密度要单独做，精密度可以同一个浓度重复测定6次，求得RSD。5、这个不知道。 另外给你附一分方法验证的PDF，可以参考。 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4546458 |
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xiaohuibit4楼2012-06-06 09:29:11
