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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 方法验证实验这么做对吗？
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xiaohuibit

银虫 (小有名气)

[求助] 方法验证实验这么做对吗？

LOD和LOQ的做法：
    QL = 10 σ  /S
    DL=3.3σ  /S
where  σ  = the standard deviation of the response
          S = the slope of the calibration curve
The slope S may be estimated from th ...
谢谢您的回复。我本来是分析的门外汉，但是现在人在国外，只能做这方面的研究。快被所谓的方法验证理论逼疯了，已经接近两个月了，我查了很多资料，但是发现几乎所有的人对验证过程的细节均一带而过，就给出一个什么加标实验，回收率的表格，有的甚至就一句话。所以我估计我的问题不在于看资料少，而在于细节东西心里没把握。
比如我用荧光淬灭剂先去抑制一种染料的荧光，然后在这个体系中加入待检物后发现荧光重新增强。那么我要验证我提出的这个分析方法，照我的理解是不是应该按以下步骤进行：
１首先根据先期实验结果，选取几个浓度点(如７个点，每个重复测３次，取平均值)，测试荧光强度，然后做用荧光值或者荧光面积值(顺便问一下用面积计算，应当取什么区间，有没有标准规定，还是自己看着办)为纵轴，以浓度为横轴，做出线性关系来。在我理解这个线性关系就是所谓的标准曲线。而曲线不一定非要过零点吧。如果有截距和斜率，貌似斜率就是上述公式中的S,那么截距是不是没什么用？还是也有其他用处？
２得到线性相关系数大于３个９的工作曲线之后，是不是就可以做检出限了？具体方法我觉得好像是取一个低浓度的试样，重复检测１１次，然后得到１１个不同的荧光强度，是把这１１个荧光值直接求标准方差，然后除以斜率再乘以系数就可以得到检测限了吗？(就是用你给出的两个公式)还是应该将这１１个荧光强度值代入工作曲线，得出１１个浓度值，求浓度的标准方差呢？(或许两者是一个值，本人数学比较差，所以不清楚)。因为我始终搞不明白σ  /S的比值为什么会是浓度的量纲呢？费解呀。。。。到底中间过程是怎样呢？跪求高手指教！
３在得到检出限的基础上，我是不是可以做加标回收率试验了。具体方法是在一个已知待测物含量的样品中加入已知浓度一定量的待测样，然后就得到一个新的荧光值，代入工作曲线，得到加样之后的浓度，回收率的求法是用加样测得的浓度算出质量减去未加样前待测物质量的差再除以加入的待测物质量，对吗？那么所谓的RSD又是怎么回事呢？是每个加样浓度重复测５次，计算出的recovery的相对标准偏差吗？还是浓度的偏差？不清楚呀。。。。
４用浓度的标准方差或者相对标准方差是不是就能说明精密度和准确度了，还是又需要做什么其他实验？
５　如果想发表文章，是不是必须用生物体的样本(比如尿样或者血清样本)进行稀释后检测，才能最终确认方法的正确性。也就是检验一下方法的抗干扰能力。对不对呢？
以上是本人的拙见，我学习了很久还是不得精髓，时间紧迫，还希望各位从事这方面研究的专业人士不啻赐教，在下感激不尽！！！
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1楼2012-06-06 02:48:36
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xiaohuibit

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
xiaohuibit: 回帖置顶 2012-06-10 04:42:32
引用回帖:
4楼: Originally posted by xbqewpq at 2012-06-06 09:29:11
这个范围就是你要检测的样品浓度的上下区间，比如50%~150%（你说的七个点就在这个范围）。截距和斜率都没用。至少在液相是没用到。
2、检测限是你检测到的最低样品浓度。它不需要重复测。一次就够。

3、回收率做 ...

谢谢回复，急问：最近在实验数据处理中发现，响应信号如果与待测物浓度的对数值呈线性，这样可以吗？由此得到的线性曲线能视为标准曲线或者工作曲线吗？
与浓度的对数值成正比，是不是反映出本人所提出的检测分析方法灵敏性不够好呢？这样可以吗？有这样的先例吗？
非常感谢回复
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5楼2012-06-10 04:24:39
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xiaohuibit

银虫 (小有名气)
还有想问一下，空白样品的荧光值算不算噪声，而含待测物的检测值就是信号了？那么所谓的最低检出限＝３×S/N，是不是指３倍的空白样品荧光强度对应的那个最小浓度呢？也就是说待测样品的荧光峰应该明显高出空白样品很多，对吗？同理最小定量检测限也是如此推算吗？如果我得到的待测物信号与空白相比，只是稍高一些，是不是这样的分析方法不好呢？
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2楼2012-06-06 02:56:36
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xbqewpq

荣誉版主 (著名写手)

魂兮

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
soundhorizo: 金币+3, 感谢您用心应助，欢迎常来分析版 ^^ 2012-06-10 10:15:06
发现楼主问题真是不少啊
一个个回吧
1、线性关系是标准曲线，在你的验证中，只需要做一个范围内的曲线。
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红颜远，相思苦，几番意，难相付。十年情思百年渡，不斩相思不忍顾！
3楼2012-06-06 09:09:31
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xbqewpq

荣誉版主 (著名写手)

魂兮

【答案】应助回帖


xiaohuibit: 回帖置顶 2012-06-10 04:24:43
这个范围就是你要检测的样品浓度的上下区间，比如50%~150%（你说的七个点就在这个范围）。截距和斜率都没用。至少在液相是没用到。
2、检测限是你检测到的最低样品浓度。它不需要重复测。一次就够。

3、回收率做法是对的。但要做不同浓度的回收率，比如样品浓度的，50%、80%、120%。三个浓度，每个做三次。RSD就是测得的九个结果的相对标准偏差。RSD是一个百分比。没有单位。
4、精密度要单独做，精密度可以同一个浓度重复测定6次，求得RSD。5、这个不知道。

另外给你附一分方法验证的PDF，可以参考。
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4546458
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xiaohuibit
红颜远，相思苦，几番意，难相付。十年情思百年渡，不斩相思不忍顾！
4楼2012-06-06 09:29:11
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