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lockye

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[交流] 细胞培养观察已有5人参与

说明：本文所涉及的内容是作者多年关于细胞培养工作的总结，单并不代表所有细胞都适用这些观察。文中的内容仅限于哺乳动物细胞系，贴壁细胞，培养基为常规的MEM、DMEM、1640以及199等。
观察无疑是细胞培养工作中最最重要的环节，因为对细胞的评价以及进一步的工作，几乎都是来源于对细胞观察而得出的。一个好的细胞培养者，首先必须是一个具有细致和耐心的观察者。无论是对于科研单位还是生产单位，细胞观察最重要的目的就是判定细胞是否被污染。值得多说一句的是，污染并非狭义的单指细菌污染，而是包括了化学药剂污染，细菌污染，真菌（酵母）污染，支原体污染以及病毒污染在内的广义概念。
细胞培养观察，按观察对象分可为培养基的观察和细胞的观察；按培养过程观察可分为消化观察、悬液观察、初期培养观察和单层观察。
一、培养基的观察
1、  培养基的颜色：对于哺乳动物细胞培养，一般的培养基添加了指示剂酚红，其颜色随着培养基PH值的改变而变化。我们可将其颜色大致分为四个类型：锐利的紫红色（玫瑰红）、柔和的红色、略带黄色的橘红色和黄色。
①    紫红色：采用封闭式培养方法，一般发生在细胞初始培养的12小时内。主要是因为细胞刚开始贴壁，细胞处于休整或修复，代谢尚不旺盛，加之其细胞数亦不多，而培养基中所含的碳酸盐和空气中的CO2要达到平衡，空气中CO2的含量为0.03%，此时培养基的酸碱平衡向左进行，导致PH值上升所致。在CO2培养箱中培养细胞，这种现象一般不会发生。
②    柔和的红色：随着细胞代谢的加强，细胞数的增多，细胞代谢产生CO2，促使培养基PH下降，一般发生在细胞培养的24小时左右。
③    略带黄色的橘红色：随着细胞数的增多，细胞代谢产生的CO2和代谢废物的增多，培养基PH进一步下降，颜色将向黄色转变，一般发生在细胞培养的48小时左右，如果细胞培养物健康且未受污染，这种情况可能会持续较长时间。
④    黄色：黄色的发生可能与三方面的情况有关。其一是污染；其二可能是由于细胞培养时间过长而未更换新鲜的培养基导致；其三有可能和细胞本身特性和健康程度有关。
从细胞培养开始后，一般每天观察两次，根据培养基颜色可能反映出一定的信息。
紫红色：细胞数可能过少或大量死亡；培养瓶可能密闭不严，有漏气现象；细胞可能遭受到污染。此时需结合其他观察。
柔和的红色：颜色基本正常，还需结合其他方面的观察。
略带黄色的橘红色：细胞数可能过多或正常，但不排除污染的可能性，需结合其他方面的观察。
黄色：可能存在污染，需结合其他方面的观察。
2、  培养基澄清度
培养基澄清度是一个很容易被操作者忽略的问题，在大量细菌污染的时候，人们很容易看到培养基浑浊，但是由于细胞培养过程中常常添加双抗，污染很可能是逐步加深的，在污染爆发之前，培养基很可能也是逐步浑浊和产生颜色变化的，这一点需要特别注意。在观察培养基浑浊度的时候需要长期敏感的观察经验，或者常设一瓶阴性对照。
①    培养基极浑浊，透光率极差，培养基颜色发黄，可能提示有细菌污染。
②    培养基稍显浑浊，培养基颜色发黄，可能提示有支原体污染。
③    培养基浑浊，可能存在肉眼可见颗粒、片层，颜色变化不明显，可能提示存在真菌或酵母污染。
④    培养基浑浊，存在大量颗粒或团块，培养基颜色紫红，可能提示存在化学药剂污染。
培养基浑浊并不一定代表了污染，但是污染的细胞一定会浑浊。这里需要注意的是浑浊的程度，如在细菌大量污染时，浑浊是显而易见的，但是支原体污染以及前期细菌的潜在污染，培养基的浑浊就不那么容易被观察到，尤其是支原体污染，其浑浊几乎是观察不出来的，还需要长期的经验积累。
如果细胞是在Flask瓶中培养，可以将瓶竖立从侧边观察，可能会有意外收获。
3.培养基的镜下观察：很多人在用显微镜观察时，只观察细胞单层的状态，其实在镜下观察培养基状况也是非常重要的。
健康的细胞培养物，在镜下观察培养基，除了极少数浮游死细胞外，几乎观察不多其他杂质的存在。如果观察到有其他杂质的存在，都可能提示培养物存在问题。如果浮游颗粒过多，则要注意的是，浮游颗粒与细胞大小的比对，浮游颗粒是否聚团，是否有纤维样状态，颗粒是发亮还是发暗等。若颗粒较细胞小，发亮，聚团，具有纤维样或发暗等，这些都是被污染的特征。
二、细胞单层的观察
操作者观察细胞单层时，应不急于先镜下观察，首先在灯光下用肉眼进行观察，初步判断细胞单层生长状态。
1、细胞单层的肉眼观察
①透光率：主要判断细胞多少，贴壁状态等，若通过单层透过来的光很强，基本上细胞数少或刚形成单层；若通过单层透过来的光很弱，基本上细胞数多或已形成致密单层。
②透光均匀性：主要判断细胞贴壁均匀度，若通过单层透过的光线均匀，则单层生长均匀；若透过单层的光线不均匀，则细胞单层生长不均匀，也有可能细胞层板块式生长，这有可能与细胞特性、瓶子的清洁度或消化情况有关。
2、  细胞单层的镜下观察
①    细胞表面洁净程度：健康培养物表面应该是很干净的，可能会有死细胞团块，都属于正常现象，但如果存在其他杂质，则需仔细观察杂质的多少，颗粒性，性状，亮暗程度等；
②    细胞极性：细胞都有自己的极性状态，如成纤维细胞表现为两极性，呈梭形，上皮类细胞则表现为多极性。
③    细胞折光率：即细胞明亮程度，健康的细胞在镜下观察是非常明亮的，若细胞发暗则提示细胞健康程度有损，可能被支原体污染。
④    颗粒性：细胞质是否有颗粒性，在倒置显微镜下，细胞除细胞核外，细胞质几乎观察不到任何东西，若感觉细胞质有颗粒性被观察到，则提示细胞健康有损，可能被支原体污染。
⑤    细胞膜：细胞膜是否有毛糙感，正常情况下，健康细胞胞膜光滑，若细胞被观察到毛糙感，则提示细胞健康有损，有可能存在细菌污染。
⑥    细胞边界：细胞与细胞之间的界限应该清晰明显。若感觉到细胞边界不清，模糊一片，则提示细胞健康有损，可能与酸碱度，培养器皿或微生物污染有关，结合第⑤点，细胞边界有颗粒性，上下移动物镜，颗粒可能发亮，则提示有可能被细菌污染。
⑦    空泡化：细胞是否有空泡化现象，正常培养下比较少见，推测可能与药物的使用有关。
⑧    细胞饱满度：细胞应该是饱满而有光泽的，若缺乏光泽不饱满都说明细胞存在一定的问题。
按细胞培养过程观察
三、细胞消化状态的观察
即在对单层细胞消化过程中的观察，主要从消化的均匀度、细胞圆缩的程度、细胞解离程度、消化时间的长短、细胞亮暗程度以及细胞脱壁状态几方面进行观察，这一点需要根据细胞特性和操作者长期的经验进行判断细胞好坏。
细胞重悬后则应加上对悬液的观察，判断是否存在污染。
四、初始培养的观察
很多人在细胞培养24小时内不会移动细胞，其实在细胞初始培养的3~5小时内即可对细胞进行观察。若细胞健康，此时细胞应大部分已经贴壁且开始铺展，表现出细胞极性来。如果细胞在这个时候未能贴壁，或者贴壁少，且未能铺展，也没有细胞极性，或者细胞明显形态不正常，都说明细胞或培养工作存在一定的问题。

讨论：需要注意的是，细胞的观察是建立在长期的细胞培养工作基础上，观察者必须细腻的观察每一个细节。单个的指标可能提示细胞污染，但不是绝对污染，还必须结合其他方面的观察尤其是镜下观察，是否具有典型的特征，譬如说：早期潜在的细菌污染一般特征是，培养基带黄或黄色、培养基一般浑浊（需仔细观察），细胞间具有颗粒性（典型特征）。每种污染都具有其独有的特征，这些还需要大家在工作中不断的总结，也希望大家能相互交流，共勉。

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