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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 大片段连接
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lwq652

木虫 (正式写手)

[求助] 大片段连接

我有一个很大的片段，5k多，但是载体也就5k多，连接了一个多月了还是连不上，请问有没有什么好方法或者好的试剂（盒）可以把类似于我这样的条件的片段连接的。我现在用的是酶切连接。目标序列都是已知的，谢谢啦
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一念错，便觉百行皆非，防之当如渡海浮囊，勿容一针之罅漏
1楼 2012-06-03 00:33:57
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+2, 见识了~4°还能一个星期呢~有点太长了吧 2012-06-05 08:34:31
公司里面连的方法是将两片段于4℃放置一个星期，可以试试，其实应该还好的，我以前连6.5k也没问题，就是长的克隆少点，但有阳性就可以了。祝福楼主！
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7楼2012-06-04 15:42:38
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普通回帖

roger077

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-06-03 20:29:31
lwq652: 金币+2 2012-06-03 21:56:53
你可以尝试一下利用同源重组克隆技术的试剂盒，应该是可以，之前我用过金斯瑞的试剂盒，还不错，另外clontech也有这种盒子，不过比较贵
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2楼2012-06-03 15:37:00
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
怎么知道没连接上呢
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3楼2012-06-03 22:24:12
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wanglei512

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+2, 有道理~虽然麻烦点，分步连接也是个可选的方法 2012-06-05 08:32:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by gongeleven at 2012-06-03 22:24:12
怎么知道没连接上呢

根据5K片段里的酶切位点 ，把它弄成两段或三段，然后一段一段的连
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4楼2012-06-04 08:43:49
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xzx018

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+1, 我连过接近4k的，用的普通的方法，操作的时候多加小心就行了~ 2012-06-05 08:33:29
我3000多的连上了 载体是t载体才两千多，模板还好的情况下应该算比较好连吧
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5楼2012-06-04 09:15:51
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draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+1, 入门载体是什么意思啊？怎么以前没听说过呢 2012-06-05 08:34:08
引用回帖:
2楼: Originally posted by roger077 at 2012-06-03 15:37:00
你可以尝试一下利用同源重组克隆技术的试剂盒，应该是可以，之前我用过金斯瑞的试剂盒，还不错，另外clontech也有这种盒子，不过比较贵

5kbp的片段，估计Gateway也够呛啊，入门载体能不能构建都是个问题。还不如把片段酶切了，分段连，这样还比较靠谱。
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6楼2012-06-04 09:50:38
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+2, 这个信息比较有用，lz可以尝试一下哈~ 2012-06-05 08:34:56
宝生物有个in-fusion的试剂盒据说可以用于大片段连接或者是多片段连接
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8楼2012-06-04 17:13:47
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+2, 萝卜丝儿得到的质粒克隆应该18k了，大质粒操作起来可是相当有难度的~ 2012-06-05 08:35:41
只要坚持连，一定连得上。。。我把6.7kb的片段连到11k的载体上也硬是做了一个多月才做出来。还有换一个效率高的感受态会有很大帮助
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好好学习，天天向上！
9楼2012-06-05 02:50:57
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个应该很好连吧啊，我以前用SK载体连接了2-15kb之间的片段，都比较轻松的
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
10楼2012-06-05 17:06:53
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