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linfeifei

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 求助CFSE标记检测细胞增殖已有1人参与

各位大虾好，我用CFSE标记细胞后流失细胞术检测，但没有见到多个峰，想请教一下问题在哪？我是用CFSE标记细胞后，FBS洗涤两次，ConA刺激72小时后检测的。但是我在显微镜下看到了明显的增殖克隆团。会不会是流失细胞仪的参数设置问题啊？
附图如下：

空白对照

偶然见到的一次实验结果，但也不是很好，后来再做不出来了

一般的实验结果都是这样的，只有一个峰，没有检测到细胞增殖

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1楼 2012-05-29 18:01:40

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打哈欠的人

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

楼主后来进展如何？
我也遇到了相同问题……刚刚发了一个贴求助……

好吧，我应该先检索一下再提问的
我也是仅对脾进行了红细胞裂解的处理。文献中说要加辅助性细胞，我们没有纯化过应该不需要吧？
还有培养基的问题，是不是需要加巯基乙醇、HEPES?
刺激物光用conA行吗？有的还加了IL-2，各种各样的
CFSE您用的多少浓度呀？貌似40μM也可以……

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11楼2015-05-31 15:58:14

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眼镜蛇

金虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

寻梦五世: 应助指数+1 2012-06-15 22:53:20

可能是cfse的浓度有问题。从cfse的分布看，电压没有问题。染色完成后，要适当终止，从37度取出来，放到冰上终止5－10分钟，然后再离心洗2－3次，洗的时候缓冲液体积要是染色体系的10倍以上。如果这些都没有问题，要考虑：
流式gating的设置，是否正确？
死活细胞的排除，是否正确？

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2楼2012-06-15 07:31:14

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linfeifei

铜虫 (初入文坛)

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 眼镜蛇 at 2012-06-15 07:31:14
可能是cfse的浓度有问题。从cfse的分布看，电压没有问题。染色完成后，要适当终止，从37度取出来，放到冰上终止5－10分钟，然后再离心洗2－3次，洗的时候缓冲液体积要是染色体系的10倍以上。如果这些都没有问题，要 ...

谢谢回复，我现在正在试验是否是CFSE的浓度有了问题，可能使用剂量低了