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mche2005

木虫 (正式写手)

7-5-3

MolEPI: 1
应助: 11 (小学生)
金币: 2811.7
散金: 63
红花: 7
帖子: 455
在线: 135.5小时
虫号: 1198543
注册: 2011-02-01
性别: GG
专业: 微生物生理与生物化学

[求助] 在用CTAB法提取曲霉总DNA时，提取很多次没有成功，期望大家多多帮助。

1、PDA培养适当时间（72h），真菌菌丝体9000转离心3min，滤纸吸水。吸除绝大部分水分，否则，含水量过大会严重影响液氮研磨的效率。
或者直接用灭菌的八折纱布进行过滤。
2、研钵（液氮研磨）至粉末。快速研磨，严防液氮溅射。研磨过程中防止样品因为液氮挥发所导致的冻融。
3、加入预热的CTAB700uL，轻柔的颠倒混匀，65℃水浴1h（每隔10min摇一次），室温12000rpm，10min，吸取上清。
4、加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），12000rpm，5min，取上清（500uL）。
5、加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），12000rpm，5min，4℃离心后，取上清液（500uL）。
6、加入-20℃预先冷存异丙醇（2/3体积），-20℃冰箱沉淀1h。12000rpm，10min，4℃离心后取上清。
7、75%乙醇洗涤2次，12000rpm，3min，4℃离心。
8、室温晾干10-15min，加入20-50uL TE溶解。
9、加入RNase A (10 mg/mL) ,37℃保温30 min 以上。
10、取 4u L 电泳。加入1uL Rnase 37摄氏度消化30min，电泳检测结果

结果，提了很多次都没有成功，请问是什么原因？

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1楼2012-05-23 11:23:36

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wsw2t

银虫 (初入文坛)

MolEPI: 1
应助: 1 (幼儿园)
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在线: 36.6小时
虫号: 1395930
注册: 2011-09-09
专业: 食品科学基础

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
mche2005: 金币+5, ★★★很有帮助, 非常感谢您的应助。您说的这两种CTAB的浓度是多少？ 2012-05-24 19:56:23

我以前提过子囊菌的DNA，很好提的，我看了你的步骤，大概有以下几点建议：
1. 可以试试用浅层液体培养菌丝，所谓浅层，就是用50ml的三角瓶，加约10ml的液体培养基吧，反正就是让菌丝长得薄薄一层，这样取菌丝的时候就很方便了，只需要用滤纸把菌丝吸干就可以研磨了
2. 液氮研磨要充分
3. 你的步骤里最严重的问题是，CTAB，我当时用的CTAB配了两种，一种是CTAB抽提液，一种是CTAB沉淀液。在氯仿异戊醇洗完两遍后，往上清里加CTAB沉淀液
4. CTAB沉淀液加完后沉淀30min，12000rpm离心，得沉淀后，将沉淀溶于高盐TE中，然后加入两倍体积的无水乙醇放在-20沉淀，顺利的话，乙醇一加进去就能看到沉淀了，那就是DNA啊！

反正从你的步骤看，主要是没有用CTAB沉淀液，我觉得，呵呵