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821078607

银虫 (小有名气)

[求助] RNA电泳

各位高手大家好，新手在此请教几个问题, 希望各位不吝赐教
请问我从细胞中提取出来的RNA经反转录用于后续PCR，要确定它的完整性，除了测OD值还要进行电泳表征吗？
另外，测吸收时全部都要用DECP水吗？一定要用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳吗，所有电泳时的溶液包括电泳缓冲夜、载样液等都要用DECP水吗，电泳槽要经特殊处理吗？
我测RNAOD值时用普通二次水稀释后，测其OD值为1.875，是不是说明只测吸收不能说明RNA的完整性？
先谢谢大家！
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1楼 2012-05-20 13:19:12
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

kuaile-RJ

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，谢谢分享经验 2012-05-21 17:22:34
821078607: 金币+4, ★有帮助, 谢谢~~ 2012-05-21 22:23:42
呵呵，我也是个新手，特别是对于细胞核酸的提取来说。我提植物组织的核酸较多。在此说一下我的感受。
1.RNA提取出来要验证其完整性，一般是通过测OD和跑电泳结合来看，OD260/OD280在1.6-2.0都可以，跑胶的话跑个普通的琼脂糖凝胶就可以了，主要是28s和18s的亮度，5s一般不能太亮，否则大都是降解了
2.测OD时稀释和空白最好用你溶RNA的液体，这样测得的结果才比较准确。电泳时电泳缓冲液和载样液其实也不用DEPC,不过最好换新鲜的电泳液。电泳槽拿纯净水冲冲就可以。跑胶过程比较快，RNA在此过程中也没么快降解。
3.只测OD260不能说明其完整性，但可以计算其浓度。

以上是个人实验的感受和经验，如有不对的地方还请指教，希望对你有所帮助！
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3楼2012-05-21 01:17:31
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普通回帖

cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-20 18:51:35
821078607: 金币+2, 谢谢~ 2012-05-23 22:00:39
溶解RNA是用DEPC水，别的地方不用，电泳不用变性也可以，OD值为1.875已经很好了，虽然RNA易降解，但也不用这么小心
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我努力我奋斗我成功
2楼2012-05-20 17:16:20
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xiaotianxin

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
821078607: 金币+2, ★有帮助, 谢谢 2012-05-21 22:23:58
溶解RNA用DEPC水，跑电泳用普通的就可以，但是跑电泳能用到的所有东西都用75%酒精擦拭一遍，电泳buffer换新的即可。
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4楼2012-05-21 10:53:19
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-21 17:22:48
821078607: 金币+2, ★有帮助 2012-05-21 22:24:37
百度一下提取RNA的操作或注意事项。
1、提取过程所用到的试剂或器皿均应无RNase污染。具体的去RNase可百度，随处可见。
2、溶解RNA肯定需要用DEPC水（0.1%DEPC处理过然后高压灭菌，或直接购买DEPC-Water（RNase-free））.
3、一般的实验要求测OD及跑电泳。测DOD
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伟大航线....
5楼2012-05-21 11:09:46
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longrna

新虫 (正式写手)
更精确可以用Agilent 2100来检测，会得出一个RIN值（RNA Integrity Number）
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伟大航线....
6楼2012-05-21 11:11:30
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dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-22 13:44:39
前面都说的很对。跑胶可以不用甲醛胶，只要把缓冲液重新换换跑出来就很好了。我就是这样做的。跑出来电泳条带很不错。OD260/280在2.0左右还是比较好的。你要是不做RACE等试验，只是简单的反转录再做接下来的工作应该也没有问题的。
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好好学习，天天向上
7楼2012-05-22 09:15:56
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gao-feng

铁杆木虫 (著名写手)

疯子

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流哦 2012-05-23 14:04:51
我提RNA摸索了近两个月，现在算很顺利了。其实只要提取的时候小心一点，跑电泳的时候同新配制的TBE做电泳液，150v泡20min就行了。跑电泳的时候可以买专用的RNAloading buffer。跑出来条带会很好看。电泳条带很好就不用测OD值了。电泳条带上游明显的基因组污染的话果断重新提取，每次提取不要贪心，提4个样品左右为宜，太多的话提的不好。
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开开心心做科研，踏踏实实做好人。
8楼2012-05-22 22:42:26
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wxf-er

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
RNA电泳补充一点，跑胶要用高电压150V+，强电流，大概10分钟就可以了
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自然
9楼2012-05-22 23:57:25
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陈朵朵

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流哦 2012-05-23 14:05:03
我刚做完RNA电泳，RNA要用DEPC水溶，但是电泳槽不需要经过特殊处理，缓冲液也不需要，就是普通的琼脂糖凝胶电泳就可以。只要把电压调高到200V这样就可以减少RNA在电泳过程中的降解。除了测OD值，最好还是做一下电泳，一般RNA电泳都会出现两条带或者三条带，我的RNA电泳之后有两条很亮的带，而且28S的比16S的条带亮一倍。
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10楼2012-05-23 10:43:40
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