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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】藻类protein的测定
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shaoxin816

银虫 (正式写手)

[求助] 【求助】藻类protein的测定

本人要测定螺旋藻中protein的含量，打算用SDS-PAGE或者Lowry法~问题来了，测定之前需要那些预处理？刚刚接触~不懂不懂。
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1楼 2012-05-11 15:36:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

87chenlin

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
shaoxin816: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 谢谢啦~~ 2012-05-14 19:56:59
2 细胞蛋白含量的测定
蛋白质测定采用考马氏亮蓝染色法，以牛血清清蛋白做标准物。
(1) 考马斯亮蓝G-250溶液的配制
准确称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95％乙醇中，加入85％磷酸100mL，用蒸馏水定容到lL，滤纸过滤后，保存于棕色瓶中。
(2) 蛋白质标准溶液的配制(100 ug／mL)
采用5mg/ml的标准牛血清白蛋白溶液，加蒸馏水溶解并定容，配制成100ug/ml。
(3) 标准曲线的制作
从100 ug/ml的蛋白质标准溶液中分别准确吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10ml试管中，并加入相应量的蒸馏水至1ml后加入5.0 mL考马斯亮蓝溶液充分混合，放置至少2 min，用l cm光径比色皿在595nm下测得溶液吸光度。以蛋白质浓度(C)为横坐标，以吸光度(A)为纵坐标，得出标准曲线为A=0.0081C+0.0024，R2=0.9978。
(4) 蛋白质含量的测定
准确吸取藻液5 mL，5000 r／min转速下离心10 min后，倒掉上清液，加入同等量0.1M的PBS。超声波破碎仪选择功率30%，Pause On 3 s, Pause Off 1s,冰浴。破碎完全后，5000 r／min转速下离心10min，取1 mL上清液，加入5mL考马斯亮蓝溶液，用1 mLPBS和5mL考马斯亮蓝混合溶液作对照，在595 nm波长下用紫外分光光度计测其吸光度值。根据标准曲线换算蛋白质的含量。
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4楼2012-05-14 18:35:14
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87chenlin

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以用考马斯亮蓝法啊吧，我就是用这个方法，先做超声波破碎
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2楼2012-05-11 23:02:50
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shaoxin816

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 87chenlin at 2012-05-11 23:02:50:
可以用考马斯亮蓝法啊吧，我就是用这个方法，先做超声波破碎

那能将具体的方法发给我吗？谢谢啦！
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3楼2012-05-14 16:46:36
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fangfeiyayun

银虫 (初入文坛)
很好，谢谢呀
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5楼2012-05-15 11:55:52
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shaoxin816

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 87chenlin at 2012-05-14 18:35:14:
2 细胞蛋白含量的测定
蛋白质测定采用考马氏亮蓝染色法，以牛血清清蛋白做标准物。
(1) 考马斯亮蓝G-250溶液的配制
准确称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95％乙醇中，加入85％磷酸100mL，用蒸馏水定容到lL， ...

你好，麻烦在问你一下，螺旋藻离心后，上清液还是漂浮部分藻，怎么办？
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6楼2012-05-16 10:51:19
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87chenlin

铜虫 (正式写手)
螺旋藻离心要转速高点吧，不然离不下去，可以选择过滤
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7楼2012-05-18 18:25:17
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情难独奏

新虫 (初入文坛)
楼主现在的超声条件具体是多少啊，我最近也在做这一方面，始终不理想啊，超声后镜检藻细胞还是完整的，而且测定酶活也很低。你现在解决了没啊。
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8楼2012-05-23 17:02:12
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sofeiya

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 87chenlin at 2012-05-14 18:35:14
2 细胞蛋白含量的测定
蛋白质测定采用考马氏亮蓝染色法，以牛血清清蛋白做标准物。
(1) 考马斯亮蓝G-250溶液的配制
准确称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95％乙醇中，加入85％磷酸100mL，用蒸馏水定容到lL，滤 ...

方法很好，但是也出现了楼下的情况，就是超声后细胞还完整，那应该怎么办呢？另外请问楼主有没有相关的文献，麻烦分享一下，感谢
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9楼2015-11-26 22:34:16
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sofeiya

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 情难独奏 at 2012-05-23 17:02:12
楼主现在的超声条件具体是多少啊，我最近也在做这一方面，始终不理想啊，超声后镜检藻细胞还是完整的，而且测定酶活也很低。你现在解决了没啊。

请问你的问题解决了没有呀？我的也是超声后藻细胞还完整，应该怎么办？求介绍经验，谢谢
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10楼2015-11-26 22:35:55
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