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紫菱Kitty

金虫 (小有名气)

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[求助] 【求助】小鼠囊胚的RNA-FISH

我最近在做一个实验，研究小鼠囊胚的RNA表达情况，用的荧光探针。
首先考虑的使用全程悬浮法做RNA-FISH：
1.用酸去透明带
2.4%多聚甲醛固定10min
3.PBs洗三遍，每次5min
4.10mg/ml蛋白酶K处理5min
5.PBs洗三遍，每次5min
6.放入含50%甲酰胺的杂交液预杂交5min
7.放入含探针的杂交液37度过夜
8.PBs洗三遍，每次5min
9 DAPI染色
或者：
改用贴片的方法做，试图首先把胚胎固定在玻片上使外观形态不变化。
1.用酸去透明带
2 PBs洗三遍，每次5min
3 在6mg/mlBSA的PBS中洗一遍
4 直接滴在多聚赖氨酸包被的载玻片上，干燥30min
5 多聚甲醛固定10min
610mg/ml蛋白酶K处理5min
7.放入含50%甲酰胺的杂交液预杂交5min
7.放入含探针的杂交液37度过夜
9.PBs洗三遍，每次5min
10 DAPI染色

这是在网上看到一位仁兄发的protocol，但是这两个方法他都没用得到理想的结果，第一个的问题：得到的图片差，有信号但有很多杂点，另外囊胚转移至50%甲酰胺里因为渗透压的原因立即收缩变形了，得不到完美的球状囊胚图片。
第二个：发现掉片非常严重，即使存在的囊胚也无信号。掉片是因为前期固定在玻片上没有做好，但怎么可以固定好呢？

在此求教小小木虫的大侠们！！！！跪求小鼠囊胚RNA-FISH的实验步骤！！！！

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