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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定量PCR读取荧光值的步骤需要保持多长时间？
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 定量PCR读取荧光值的步骤需要保持多长时间？

各位朋友好！最近做定量PCR遇到了点问题，仪器是ABI7300，在延伸步骤读取荧光值会有非特征峰，所以想在后面加一步高温步骤（约80-85度）读取荧光值，想问一下通常这一步需要保持多长时间？谢谢！
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1楼2012-05-09 09:19:27
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学术问题

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-12 15:39:48
呵呵，不好意思，孤陋寡闻了，之前没听说过有这么做的
刚看了下天根的资料，有提到如果有引物二聚体怎么处理，其中一个方法是“在延伸反应结束之后加上一个温度（高于引物二聚体解链温度而低于目的片段解链 ...

可以具体发一个程序图吗？是在每一个循环后加一个79度 5s 吗？比如我用的这个程序怎么改？
定量PCR读取荧光值的步骤需要保持多长时间？
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微生物小硕
13楼2013-10-09 10:58:31
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-09 13:55:14
tingspdf: 金币+2 2012-05-12 14:51:15
我觉得按照你实验的步骤设计吗，30s就行啊，或者短一点，15s左右，这一步只是读数据，关键还是你设计的温度，从溶解曲线可以看出你温度越高，值就越小这是一定的，所以温度是很重要的。实验顺利啊
赞一下(1人) 回复此楼
我努力我奋斗我成功
2楼2012-05-09 10:44:25
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 斑斑很辛苦哈 2012-05-10 13:40:22
tingspdf: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-12 14:56:12
这样是不行的哦。有非特异峰就代表有非特异扩增，如果你是两步法（退火、延伸用同一个温度），可以改为传统的三步法以增加特异性。也可以尝试提高退火温度。
如果你用的荧光染料是sybr green，只能在延伸结束时检测荧光信号，额外增加一个专门检测荧光的步骤是不可行的哦。
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3楼2012-05-09 21:21:18
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★ ★
西瓜: 金币+2, 学习了哈~ 2012-05-10 03:59:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-09 21:21:18:
这样是不行的哦。有非特异峰就代表有非特异扩增，如果你是两步法（退火、延伸用同一个温度），可以改为传统的三步法以增加特异性。也可以尝试提高退火温度。
如果你用的荧光染料是sybr green，只能在延伸结束时检 ...

西瓜大哥哦
有非特异峰值还有可能是管子的问题哦 我们经常遇到的 有些公司的96孔板会有非特异性扩增 换成好些的8-strips tube就没啥问题了
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Let God do with it as He wills
4楼2012-05-09 23:48:17
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