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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RNA干涉
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iugogo

铜虫 (小有名气)

[求助] RNA干涉

请教一下大家，我最近做RNA干涉，dsRNA的浓度分别用了50，100，150ng/ul，ddH2O溶解，以ddH2O处理和未做任何处理的样品为对照。处理3天后做荧光定量发现，3种浓度的处理都比对照上调了好多倍，不知道是什么原因，请教一下！（模板测序过，是正确的）
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iugogo

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1楼 2012-04-29 23:19:46
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heath666

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1，确定RNAi是否有效。因为不是所有设计的dsRNA都会有效果，而且你只选择一个72h时间点是不够的，建议多设计几对dsRNA，并且多加几个时间点。
2，原则上RNA水平也不能完全代替蛋白水平，可以再用WB等检测下蛋白水平。
3，即使以上条件都满足，有的时候也确实存在这个问题，原因还不确定，可能与脱靶效应或者不同基因的相互作用有关。

希望能有帮助！
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2楼2012-04-30 13:02:29
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iugogo

铜虫 (小有名气)
送鲜花一朵
非常感谢heath666的解答！在plos one 有一篇文章中，RNAi后不同时间段表达量是先上调然后再下调。我那个实验从表型上看，RNAi应该是起到作用了，我再检测几个时间段，再设计几个dsRNA看看。非常感谢您的建议！
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3楼2012-04-30 22:51:03
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nemo88

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
4楼2012-04-30 23:00:33
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
碰到上调的时候，确认一下，你做RT的引物和你的dsrna的片段两端是不一样；
要是一样的话，有时候会是dsrna里残留的dnd，如果rt引物设计在ds的外围，那就另当别论。
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活着就要让人感受到你的存在。
5楼2012-05-01 15:11:30
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dongyingqian

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

有个问题请教楼主，做对照用的dd水，有PH要求吗。还有注射量是多少啊，我最近也想做呢
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6楼2013-05-29 11:29:22
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iugogo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by dongyingqian at 2013-05-29 11:29:22
有个问题请教楼主，做对照用的dd水，有PH要求吗。还有注射量是多少啊，我最近也想做呢

我是用的DEPC处理水，没调PH值，用试剂盒里的buffer也行。根据注射对象的大小吧，要试一下，我注射的是虫子，有一个绿豆那么大，0.5微升左右，也死了一些，多了会死更多
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7楼2013-05-29 17:40:03
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